[发明专利]一种维生素K2及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种维生素K2，尤其涉及的是一种维生素K2及其制备方法。

背景技术

维生素K（VK）是一族含有共同化学结构（2-甲基-1,4-萘醌环）的物质的统称，根据萘醌环3’位置所连接侧链化学结构长度的不同，VK又分为不同的类别，天然存在的VK主要有两种类型，即维生素K1（叶绿醌类，简称PK）和维生素K2（甲萘醌类，简称MK），都属于脂溶性维生素，均可由微生物合成。维生素K2的化学结构式为2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌，分子式为C₁₆H₁₆O₂﹒(C₅H₈)n，依据C-3上异戊二烯侧链长度的不同，维生素K2可分为14种，通常以MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二烯单元的个数，其中利用黄杆菌发酵产生的维生素K2的主要成分为MK-4、MK-5或MK-6中的一种或多种，其主要成分的分子式分别为：C₃₁H₄₀O₂，C₃₆H₄₈O₂，C₄₁H₅₆O₂，结构式如下所示：

维生素K2的生物活性主要体现在促进凝血酶原的产生和增加骨钙素的合成上，在血液凝固以及骨骼代谢中有重要作用，可用于治疗和预防维生素K2缺乏引起的出血症和骨质疏松症，并可降低肝硬化转化为肝癌的风险，在增加人体骨密度方面优于其他维生素K。近年来，自然和科学等顶级国际期刊上都相继发表了维生素K2具有修复损伤细胞的新功能，这些新功能的发现，将促使维生素K2更加广泛地应用于医药、食品等领域。

维生素K2的制备方法中微生物发酵法因其原料易得、条件温和、环境压力低，且具有高生物活性和高生物相容性、易于人体吸收与利用等特点而备受青睐。目前能够进行发酵生产维生素K2的菌种主要属于革兰氏阴性菌的黄杆菌和革兰氏阳性菌的纳豆芽孢杆菌。其中，纳豆芽孢杆菌生产维生素K2因产量极低而只限于在食品行业中应用。在利用黄杆菌发酵生产维生素K2方面，日本的谷吉树（TaniYoshiki）课题组在菌种选育和发酵培养条件优化方面做了很多的工作，他们采用结构类似物抗性初筛结合NTG和紫外诱变筛选高产菌，得到了1-羟基-2-萘甲酸抗性菌株HNA12-D，并结合表面活性剂渗漏技术，使维生素K2的总产量提高达280mg/L。然而，产量低仍然制约着维生素K2的广泛应用，无法使其满足市场的需求，因此，如何得到较高的维生素K2产量成为目前研究的焦点。

另外，大多数微生物发酵法生产的产品，发酵液往往成分复杂，产品分离纯化难度较大，因而选择合适的下游技术是保证生产工艺成功的一个极其重要的环节。有报道采用有机溶剂提取、反向薄层色谱、固相萃取高效液相色谱法等分离纯化方法来提取和精制维生素K2，取得了较好的效果。等人采用凝胶层析成功分离维生素K2，Berger等研究者运用超临界色谱，CO₂为流动相，快速分离K1的顺反异构体，但这些方法多限于实验室规模，若进行工业化生产则成本很高，因此开发一种适合于工业化生产的简单廉价的维生素K2分离和提纯方法有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种维生素K2及其制备方法，以解决现有技术的制备方法不能应用于工业化生产的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

一种维生素K2的制备方法，包括以下步骤：

（1）取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，30～38℃下培养24小时进行活化，然后置于4℃下保藏2～15天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌，通过控制菌种的斜面保藏时间，可以抑制菌体的生命活动，但也不至于使菌体进入休眠状态；

（2）取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，在30～38℃下摇瓶培养24～48小时，获得种瓶培养物；

（3）取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于28～38℃下发酵培养120～144小时，获得发酵液，发酵培养期间每隔20～30小时补加营养物质，所述营养物质为甘油、蛋白胨和维生素K2生物合成的前体物质，通过碳源甘油、氮源蛋白胨以及前体物质的分批补料，可以获得维生素K2在菌体内的高效代谢；