[发明专利]适配体修饰的纳米银探针及其试剂盒与在检测PDGF-BB中的应用

权利要求书

1.一种适配体修饰的纳米银探针，其特征在于，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链；

其中，所述的适配体链为：

5’-SH-(CH₂)₆-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；

其中，所述的寡核苷酸链为：

5’-SH-(CH₂)₆-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。

2.权利要求1所述的适配体修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为1：3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；

(2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比(1～9):(1～99)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10～24小时，适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1；

其中，所述的适配体链为：

5’-SH-(CH₂)₆-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；

其中，所述的寡核苷酸链为：

5’-SH-(CH₂)₆-AAAAAAAAAAAAAAA-3’；

(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1×PBS，静置3～10小时；

(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入1～5mol/L氯化钠溶液，静置2～4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1～4次，使得氯化钠的终浓度为0.1～0.3mol/L；

(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24～72小时；

(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍；最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。

3.根据权利要求2所述的适配体修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的离心条件为10000～20000rpm条件下离心10～30分钟。

4.权利要求1所述的适配体修饰的纳米银探针在制备检测PDGF-BB的试剂中的应用。

5.一种用于检测PDGF-BB的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下试剂：适配体修饰的纳米银探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20、anti-PDGF-BB抗体、PDGF-BB蛋白、氯金酸、氢醌、牛血清白蛋白、醛基片基。

6.权利要求5所述的用于检测PDGF-BB的试剂盒在检测PDGF-BB蛋白中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用检测PDGF-BB的试剂盒检测PDGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤：

(1)配制溶液：

稀释液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS；

洗涤液：1×PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；

阴性对照：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中，得1mg/mL BSA溶液；

封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；

底物：用1mg/mL BSA配制所需浓度的anti-PDGF-BB标准样品溶液；

显色剂：10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合；

探针：用1×PBSM溶液配制1.03nmol/L（原液）的适配体修饰的纳米银探针；

(2)将不同浓度的anti-PDGF-BB抗体溶液、待测样品和阴性对照在醛基片上点样，37℃固定2h；

(3)每孔加入10～50μL封闭液，在37℃条件下封闭1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；

(4)在不同的孔中加入不同浓度的PDGF-BB标准样品溶液30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；在其余的孔中加入30μL样品溶液，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；

(5)每孔加入1.03nmol/L适配体修饰的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；

(6)每孔加入30μL显色剂溶液，避光反应1～8min，去离子水冲洗3～4遍，拍干；

(7)用扫描仪扫描，LuxScan3.0芯片图像分析软件对图像进行处理，不同浓度的PDGF-BB标准样品溶液对应不同的灰度值，得到PDGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中PDGF-BB的浓度。