[发明专利]家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种家蚕基因重组表达载体，以及其在提高蚕丝纤维力学性能方面的应用。

背景技术

蚕丝纤维为蛋白质纤维，是一种在纺织工业、生物医学等领域具有广泛应用的纤维材料。但由于蚕丝蛋白结构上的缺陷，蚕丝纤维的力学性能相比合成纤维较差，从而制约了其在新型高分子纤维、特种材料等领域的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕基因重组表达载体，目的之二在于提供该重组表达载体在提高蚕丝纤维力学性能方面的应用；目的之三在于提供利用该重组表达载体提高蚕丝纤维力学性能的方法。

为达到上述目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

1.家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体，是将由家蚕前部丝腺特异性启动子、家蚕钙离子-ATP酶基因CDS序列和终止子组成的表达框插入含荧光报告基因的转座载体中而制得；所述家蚕钙离子-ATP酶基因CDS序列如SEQ ID No.1所示。

进一步，所述家蚕前部丝腺特异性启动子为家蚕表皮蛋白BmCP231启动子或BmCP274启动子，所述BmCP231启动子序列如SEQ ID No.4中第1位至第1457位核苷酸所示，或者如SEQ ID No.4中第1位至第1511位核苷酸所示；所述BmCP274启动子序列如SEQ ID No.9所示。

进一步，所述重组表达载体是将由家蚕表皮蛋白BmCP231启动子、家蚕钙离子-ATP酶基因CDS序列和SV40终止子组成的表达框插入pBac[3xP3-EGFPafm]载体的Asc I酶切位点而制得；所述BmCP231启动子序列如SEQ ID No.4中第1位至第1511位核苷酸所示。

2.家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体在提高蚕丝纤维力学性能方面的应用。

3.利用家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体提高蚕丝纤维力学性能的方法，包括以下步骤：将家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体与编码转座酶的转基因辅助载体等摩尔比混合，显微注射入已解除滞育的产卵后2～5小时的蚕卵中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25℃催青至孵化，孵化出的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交制种，再取卵期第7天的蚕卵，在显微镜下进行荧光检测，筛选出在眼睛或神经特异发射荧光的转基因个体，获得转基因家蚕，其生产的蚕丝纤维即为力学性能提高的蚕丝纤维。

本发明的有益效果在于：本发明构建了家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体，用家蚕前部丝腺特异性启动子调控家蚕钙离子-ATP酶在家蚕前部丝腺特异表达，将该重组表达载体显微注射入家蚕蚕卵内获得了转基因家蚕阳性个体，对转基因家蚕阳性个体的研究发现，钙离子-ATP酶在mRNA和蛋白水平上都得到了过量表达，对转基因蚕丝纤维进行力学拉伸试验发现其力学性能得到显著提高，红外光谱分析发现转基因蚕丝纤维的结构发生了变化。因而运用本发明构建的家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体可以改变蚕丝纤维的力学性能，有助于获得更加优良的蚕丝纤维。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为转基因家蚕的Southern Blot检测结果，其中1为转基因家蚕基因组；2为非转基因家蚕基因组。

图2为转基因家蚕的荧光定量PCR检测结果，其中1为转基因家蚕前部丝腺基因组，2为非转基因家蚕前部丝腺基因组。

图3为转基因家蚕的Western Blot检测结果，其中1为非转基因家蚕前部丝腺蛋白样品，2为转基因家蚕前部丝腺蛋白样品。

图4为转基因蚕丝纤维的红外光谱扫描结果，其中A为非转基因蚕丝纤维，B为转基因蚕丝纤维，曲线a为红外吸收曲线，曲线b为红外吸收值通过傅里叶去卷积化后形成的曲线，箭头处为1660cm^-1的峰。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例中使用的家蚕品种为大造，由西南大学家蚕基因资源库提供。

一、家蚕钙离子-ATP酶基因的克隆