[发明专利]一种H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及动物免疫学领域，尤其涉及H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

人类感染高致病性禽流感病毒H5N1 (简称人禽流感)是人类在接触该病毒感染的病禽/死禽或暴露在被H5N1病毒污染的环境后发生的急性呼吸道传染病。1997年，我国香港特别行政区首次发生H5N1亚型人高致病性禽流感病例，并致6人死亡，在世界范围内引起了广泛的关注。2003年下半年，世界上多个国家暴发家禽和野生禽类的H5N1病毒感染，其中有14个国家出现人禽流感病例。截至2008年4月30日，由世界卫生组织(WHO)报道的全球确诊病例共378例，其中238例患者死亡，病死率高达63%。我国大陆H5N1型人禽流感病毒感染呈高度散发，从2005年4月底确诊第1例人禽流感病例以来，现已确诊30例，其中17例患者死亡，病死率为56.7%。到目前为止，禽流感已造成全球超过1.5亿只禽类被扑杀，直接经济损失高达100亿美元。H5N1型禽流感已经在15个亚洲和欧洲国家与地区传播，虽然目前未出现禽流感病毒在人群中流行的现象，但根据WHO的估计，目前H5N1禽流感仍在一些国家的禽类中流行，且流行区在不断扩大。因此，有迹象表明，H5N1型禽流感在人群中流行只是时间问题。

H5N1病毒的基因组由8个分节段的负链RNA组成，编码9种结构蛋白和2种非结构蛋白（non-structora1 protein 1，NS1；non-structora1 protein 2，NS2）。一直以来，科学家们认为划分病毒类型的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）这两种结构蛋白在禽流感病毒感染人类细胞过程中发挥主要作用，然而来自圣犹大儿童医院的研究人员在分析比对了2196个包括流感基因和169个全基因组序列（包括了人类和猪流感病毒，这是迄今包括病毒种类最多、最广泛的流感全基因组对照分析）之后，发现除了编码血凝素和神经氨酸酶的基因发生变异外，编码NS1蛋白质的基因也频繁变异。在不同亚型的流感病毒中，编码这三种蛋白质的基因序列变异最大，这表明它们决定了病毒的致病性。

NS基因是H5N1基因组中最小的基因节段，全序列为890个核苷酸，有两个编码区，分别编码NS1和NS2两种蛋白质。第1个编码区编码含202~237个氨基酸残基的NS1蛋白，在不同病毒株系间有差异；第2个编码区编码含121个氨基酸残基的NS2蛋白，其5′端有56个核苷酸与NS1相同，整个mRNA包含一个中断的含473个核苷酸的区域。NS1蛋白含有2个核定位区，其中34位~38位氨基酸残基处的信号区非常保守，在所有A型和B型流感病毒中都相同，其氨基酸排列顺序为-Asp-Arg-Leu-Arg-Arg-。第2个信号区在203位~230位氨基酸残基处，在大多数A型流感病毒中都有这一序列。有研究表明，NS1基因核苷酸替代大致是保守的，即使突变也是不连续的。早期研究表明，这两种蛋白质仅存在于被流感病毒感染的细胞中，而不出现在流感病毒粒子内，所以称为非结构蛋白（NS）。NS1在感染的早期就被大量合成并很快转移至核内，调节病毒RNA的合成、Pre mRNA的剪切、运输及mRNA的翻译过程；NS2主要在胞浆内，在感染的后期才会合成，与M1蛋白密切作用，将RNP由细胞核输送到细胞浆，在病毒的复制周期中起重要作用。随着研究的进一步深入，发现NS2蛋白在成熟的病毒粒子中少量存在，所以NS1蛋白是流感病毒唯一的非结构蛋白。因此，研究人员认为血凝素和神经氨酸酶是流感病毒感染宿主细胞、破坏机体免疫系统的关键，而NS1 蛋白只在病毒侵入机体细胞后才生成, 表明其可能在破坏被感染细胞的过程中起关键作用，可能与多个细胞内受体结合，破坏细胞内的关键信号传导通道，致使宿主细胞死亡。

虽然对于流感病毒的研究已经持续了很多年，然而到目前为止人们对于流感病毒的致病致死机理还不很清楚。比较赞同的观点是：流感病毒通过其表面的HA蛋白与宿主细胞表面受体结合，进入细胞内部快速复制，从而导致了宿主细胞凋亡，进而器官衰竭，最后导致宿主死亡。不过近年来研究发现，即使使用抗流感病毒药物有效抑制了流感病毒的复制后，宿主的死亡率并没有明显下降。这就提示流感病毒的致病致死机理可能还有其他尚未发现的途径。目前，NS1被证实能够协助H5N1逃避人体免疫系统的监视作用，NS1作为干扰素和肿瘤坏死因子的拮抗物，可以调节机体的固有免疫和适应性免疫，并在病毒复制、细胞凋亡等过程中发挥重要作用，是流感病毒一个主要的毒力因子。