[发明专利]新德里金属β-内酰胺酶的抑制肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物药物领域，具体涉及一种金属β-内酰胺酶的三肽抑制剂，尤其涉及该肽在制备抗菌药物及预防、治疗耐药菌感染中的用途。 

背景技术

产生β-内酰胺酶是导致细菌尤其是革兰氏阴性菌耐药的重要机制之一，它们能水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环，导致抗生素失活。β-内酰胺酶可以分为丝氨酸β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶（MBLs）。根据氨基酸序列的同源性以及对金属Zn离子的依赖性，MBLs又进一步分为B1，B2和B3亚类。目前发现B1类有18个同源家族，B2类有3个同源家族，B3类有9个同源家族。由于金属β-内酰胺酶能够水解包括碳青霉稀类抗生素在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素，而且目前没有有效的抑制剂上市，因此MBLs是目前临床上抗感染治疗的重大挑战，受到了广泛关注。 

B1类MBLs中的IMP、VIM以及近几年流行的NDM型金属β-内酰胺酶临床检出率最高。2010年8月《柳叶刀－传染病》杂志上报道了在印度、巴基斯坦和英国共分离得到180株含有blaNDM-1质粒基因的细菌，实验发现，它们除了替加环素和多黏菌素以外，对其他所有抗生素都具有高度耐药性。不断进化的突变株使得临床治疗更加艰难，因此开发广谱MBLs抑制剂成为医学领域的一大挑战。 

发明内容

本发明以多药耐药细菌所产生的金属β-内酰胺酶为靶标，并针对该类酶催化水解抗生素的活性中心合成了一个三肽，本发明的三肽可联合抗生素治疗多药耐药细菌感染。 

本发明的金属β-内酰胺酶抑制剂为广谱金属β-内酰胺酶抑制肽，其特征在于： 

（1）序列特征： 

i长度：3个氨基酸 

ii拓扑结构：线性 

（2）分子类型：小肽 

（3）序列描述：Phe-Cys-D-Phe，即C端的苯丙氨酸为D型结构。 

其结构式为： 

本发明的三肽结构简单，用固相合成法制备即可，方法简单，技术成熟，产物质量容易控制，能满足大规模工业化生产的需要。 

药效学试验证明本发明的三肽对典型的金属β-内酰胺酶，如NDM-1、IMP-1和VIM-2等，具有明显的抑制作用。 

药效学试验证明本发明的三肽与β-内酰胺类抗生素具有良好的协同作用，能明显抑制耐药菌生产并且大幅度降低β-内酰胺类抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。所述的β-内酰胺类抗生素优选头孢呋辛钠。 

本发明的三肽也可以和药学上可接受的盐结合，同样具有其药效。这些盐包括（但不局限于）与碱金属或碱土金属（如钠、钾、钙或镁）形成的盐。其他盐包括与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。药学上可接受的盐优选钠盐。 

本发明公开了一种抗菌药物组合物，其中含有本发明的三肽或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。 

本发明还公开了一种抗菌药物组合物，它含有β-内酰胺类抗生素、本发明的三肽或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。本发明的三肽与抗生素联合使用能有效抑制耐药细菌的生长。 

上述药物组合物可以制成注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。上述各种剂型均可以根据药学领域的常规方法制备。可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉、粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。 

一般地，本发明的三肽使用剂量在0.001～10克/天，也可以根据疾病的情况偏离这个剂量范围。 

下面是本发明的三肽的部分药效学试验及结果： 

一、三肽对NDM-1型金属β-内酰胺酶抑制活性（IC₅₀）的测定： 

以头孢呋辛钠为报告底物，在274nm波长下 

测定NDM-1型金属β-内酰胺酶水解底物后吸光度的变化。测定缓冲液为50mM HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）,250mM NaCl,2μM ZnCl2,pH=7.25,温度30℃。 

（1）首先将金属β-内酰胺酶（终浓度10nM）于缓冲液中孵育5min，使得Zn²⁺充分占据活性中心； 

（2）将三肽抑制剂的钠盐溶于缓冲液，向（1）的体系中加入10μL不同浓度的三肽溶液，30℃孵育5min，使抑制剂与酶充分结合；