[发明专利]改变水稻磷酸盐转运体基因OsPT8磷酸化位点法及用途

说明书

技术领域

本发明属于基因工程以及作物遗传改良领域。具体地说，本发明涉及一种通过对水稻磷酸盐转运体OsPT8的蛋白序列第517位氨基酸残基丝氨酸（Ser）以及其他可能的磷酸化位点进行基因工程改变。通过自身启动子启动，将改造过的Ospt8基因转基因后可改变水稻的磷吸收能力。

背景技术

磷酸盐(Pi)转运体PHT1为膜结合型的蛋白质。PHT1蛋白进入内质网（Reticulum，ER），以适当的方向插入到膜内（在系统移动中始终保持着N端和C端朝向胞质定位），进行正确的构象折叠和修饰后以膜泡（Vesicle）的形式经高尔基体（Golgi）到达质膜。由此可知Pi转运体在分泌到质膜前其活性将受内输途径的相关调控，根据前人研究结果，PHT1蛋白从ER向质膜转运受植物特有的伴侣蛋白PHF1调控（Gonzalez et al.,2005），细胞磷浓度将影响这种调控。

(1)内质网中的伴侣蛋白PHF1

通过对酿酒酵母和动物细胞的研究，人们发现蛋白从ER到质膜的转运途径中的关键步骤是合成后的蛋白从ER到Golgi的COPII（coat protein II）膜泡正向运输（Barlowe,2003b,a）。COPII的形成是由SAR1GTPase启动的，SAR1GTPase经SEC12鸟苷酸置换因子活化后，可推动COPII膜泡包被的形成以及选择输出底物（Barlowe et al.,1993；Barlowe and Schekman,1993）。将被运输的蛋白（Cargo）在并入COPII膜泡之前必需建立并维持一种适于进入分泌途径的正确构象，而这过程则需要该蛋白所特有的伴侣蛋白来协助(Herrmann et al.,1999;Barlowe,2003b)。此外，若某些cargo不被COPII的组份所识别，就需要特有的转运受体协助来进入COPII膜泡(Herrmann et al.,1999;Barlowe,2003b)。酿酒酵母中PHO86蛋白就是这样的一个伴侣，可协助酵母中高亲和磷酸盐转运PHO84正确地从ER输出，同输出PHO84一样，PHO86基因也受到酵母中磷饥饿（PHO）信号途径的调控(Lau et al.,2000)。尽管PHO84与植物中的高亲和磷转运体序列高度同源，且SEC12，SAR1及其他COPII膜组份蛋白在植物中也已有报道(Neumann et al.,2003;Jurgens,2004;Bassham et al.,2008)，拟南芥基因组中却没有搜索到PHO86类似的基因。2005年，Gonz等人通过遗传筛选的方法发现拟南芥中PHF1基因突变后会影响植物体对Pi的吸收转运(Gonzalez et al.,2005)。转基因研究表明PHT1;1无法正确定位于拟南芥phf1突变植株的细胞质膜，而是滞留于ER中。这类蛋白靶向运输缺陷在生长素输入蛋白AUX1中也有报道，axr4突变体因为缺失了ER里的一个伴侣蛋白，造成AUX1蛋白滞留于ER中，从而使植物对生长素不敏感(Dharmasiri et al.,2006)。

拟南芥中PHF1在各个组织中都见表达，并且受缺磷诱导和和PHR1调控，因此PHF1可能普遍调控全体PHT1蛋白(Gonzalez et al.,2005)。2011年Bayle等人进一步发现PHF1在蛋白水平也响应缺磷诱导，根部外皮层毛及其着生的细胞处表达尤为强烈(Bayle et al.,2011)。PHF1基因编码一个SEC12类似结构的蛋白，但却缺失其作为鸟苷酸置换因子所必需的保守残基，因此尽管PHF1在PHT1内膜运输途径的早期发挥作用，但只定位于ER，不参与COPII膜泡在ER输出位点上的复合物组成(Gonzalez et al.,2005;Bayle et al.,2011)。由此可推断PHF1对于PHT1的协助过程发生在其进入COPII膜泡之前。最近，邱子珍研究组已经通过分裂泛素酵母互作系统验证了PHF1和PHT1家族成员的相互作用，从而为PHF1作为PHT1的伴侣蛋白提供了更为直接分子证据(Bayle et al.,2011)。