[发明专利]一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法。

背景技术

花生为豆科落花生属作物，富含油脂和蛋白，是我国重要的油料作物和经济作物。花生的产量和品质受干旱、盐碱等胁迫影响非常严重，全国每年因干旱引起的花生减产率达20％以上。但由于花生品种资源遗传基础狭窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐盐的基因源，利用常规育种方法难以培育出高抗品种。随着分子生物学的快速发展，近年来利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了显著成果，对胁迫相关基因和信号转导途径也有了更深入的了解。

牛心果碱氧化酶是催化苄基异喹啉(类)生物碱合成过程中的关键酶，催化牛心果碱生成斯氏紫堇碱(Liscombe and Facchini,2008)。目前有关该基因功能的研究较少，其在非生物胁迫中的功能研究尚未见报道。本研究通过芯片杂交发现该基因在花生盐处理芯片中表达上调明显，随后对该基因进行了基因克隆及功能研究。

发明内容

为了提高花生生长的抗逆境能力，增强其耐盐、抗旱、耐低温能力，本发明提供了一种花生逆境胁迫基因AhROLP1的克隆及功能表达方法。

技术方案

一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

（1）材料的准备与处理：材料选择花生花育33，花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22-28℃，生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；

材料的低温处理，将三叶期花生幼苗置于4℃光照培养箱中进行处理，取处理时间分别为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；对于抗旱，用PEG6000处理；将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或重量浓度20%PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用；

（2）RNA的提取和cDNA的合成

按照试剂盒操作手册的方法用天根的RNeasy Mini Kit分离提取花生幼苗RNA。RQ1 RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用M-MLVReverseTranscriptase进行cDNA的合成，25-μL反应体系中包含2μgRNA。在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用；

（3）基因克隆

通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA Taq^TMDNA polymerase，在25-μL体系中加入以下成分：含MgCl₂的2.5μL 10×PCR buffer；2.5μL 10mMdNTPs；1μL cDNA模板；0.5μL LA polymerase和17.5μL ddH₂O。PCR反应条件为：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min。

扩增基因全长所用引物为AhROLP1-S:5’-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’和AhROLP1-A:5’-TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’；

PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector并测序；

本发明的AhROLP1基因开放阅读框为1620bp，共编码540个氨基酸。

本发明的AhROLP1基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与鹰嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果碱氧化酶同源性均达到了70%以上。

本发明的AhROLP1基因的核苷酸序列是序列表中序列1。

本发明的AhROLP1基因的氨基酸序列是序列表中序列2。

用荧光定量Real-time RT-PCR对AhROLP1基因逆境下的功能表达进行分析，其方法如下：