[发明专利]一种抗黑条矮缩病水稻的培育方法

说明书

技术领域

本发明属于生物和现代农业技术领域，涉及一种抗黑条矮缩病水稻的培育方法，具体地说，涉及一种基于RNAi技术的抗黑条矮缩病水稻的培育方法。

背景技术

水稻黑条矮缩病俗称“矮稻”，是由灰飞虱为传播介体昆虫的一种病毒病，水稻黑条矮缩病病原可以为害禾本科的水稻、大麦、小麦、玉米、高粱、粟、稗草、看麦娘和狗尾草等20多种寄主。矮缩病作为一种病毒病，现在没有有效药物治疗。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种抗黑条矮缩病水稻的培育方法。其技术方案如下：

一种抗黑条矮缩病水稻的培育方法，包括以下步骤：

A.RNAi载体构建

A1.目的片段的选择与获得

提取水稻黑条矮缩病病叶中的总RNA，并通过反转录得到其cDNA，通过在NCBI数据库中作同源比对，选定水稻黑条矮缩病病毒基因组S7-1中441bp特异序列作为构建RNAi载体的目的片段，通过设计含有特定酶切位点的特异引物S7-F(BamHI)和S7-R(SpeI)将该段序列扩增出来，电泳后利用胶回收试剂盒回收目的片段，加入polyA后克隆到pMD18-T载体上，在经过测序确认无误后，用于步骤A2中的载体构建；

A2.目的片段RNA干扰结构的构建

用BamHI和SpeI双酶切含有目的片段的pMD18-T质粒，同时用XbaI和Bg1II双酶切中间载体p1022RNAi，酶切产物经电泳后，回收目的片段和切开的载体p1022RNAi，通过T4连接酶将两者连接起来，并导入大肠杆菌DH5α中，经双酶切(BamHI和SacI)鉴定后挑取阳性克隆，

挑选的阳性克隆质粒再次经过双酶切(BamHI和SpeI)，随后与之前回收过的目的片段再次相连后，同样导入大肠杆菌DH5α中扩增并酶切鉴定，获得目的片段RNA干扰结构；

A3.干扰结构连入植物表达载体

步骤A2中鉴定正确的阳性克隆再经过BamHI和SacI双酶切后，回收含有目的片段RNA干扰结构的片断，与经过同样双酶切的经过改造的植物表达载体pCAMBIA1301相连，导入大肠杆菌后通过双酶切鉴定阳性克隆，最终获得了S7的RNA干扰结构的超双元植物表达载体S7-RNAi：

B.转基因水稻植株的获得

B1.以抗条武育粳3号的成熟种子在N₆D₂培养基上诱导出愈伤组织，用农杆菌EHA105／S7-RNAi侵染愈伤组织，随后置于共培养基N₆D₂C上共培养3天，再经分别含有25mg／L和50mg／L潮霉素的筛选培养基上各筛选10～15天，筛选获得较多的抗性愈伤组织；

B2.将抗性愈伤组织再经过10～15天预分化培养，之后再经过分化培养得到小苗，待小苗长势良好后转入生根壮苗培养基上生根壮苗，最终获得了32个独立转化系，将获得的转基因植株移栽入大田中，绝大多数的植株都能正常生长、开花、抽穗。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明通过构建含有水稻黑条矮缩病病毒基因组S7部分片段的RNAi植物表达载体，利用农杆菌介导的转基因方法将目的片断导入水稻的胚性愈伤组织，通过潮霉素抗性筛选、分化，获得再生转基因植株，并通过对经接虫传毒试验的转基因植株中病毒基因的表达分析表明，转基因水稻植株中病毒基因的表达明显降低。该方法利用RNAi技术，可培育出对黑条矮缩病表现抗性的水稻转基因株系，从根本上解决水稻黑条矮缩病缺少抗源的问题，显著增强水稻对该病的抗性，提高经济效益。它相对于传统的防治措施，具有节省人力、物力成本，同时能够有效解决困扰稻作生产的安全隐患，并且能够在一定程度上避免抗虫抗病毒农药的使用，保护农田生态环境，降低农产品的农药残留，保护作为食用者的人体不受有毒物质侵害，为绿色农业提供有力的技术支持。

附图说明

图1是转S7-RNAi结构对水稻黑条矮缩病毒基因表达的影响实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

一种抗黑条矮缩病水稻的培育方法，包括以下步骤：

A.RNAi载体构建

A1.目的片段的选择与获得