[发明专利]一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒、构建方法、重组工程菌及应用

权利要求书

1.一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是在质粒pET28a的基础上插入烟草叶绿体rrn16基因强启动子、大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列、烟草叶绿体rps16基因的3’端非编码区、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）聚磷激酶基因ppk和假单胞菌（Pseudomonas）K-62菌株去掉merA、merG后的mer操纵子构建而成。

2.根据权利要求1所述的用于清除工业废水汞污染的重组质粒，其特征在于，包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.一种用于清除工业废水汞污染的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据假单胞菌K-62菌株质粒pmr26和pmr28，合成人工操纵子merT-merP-merB1-merB2，将其与质粒pET28a进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p1；

（2）以产气肠杆菌DNA为模板，设计引物，扩增ppk基因；将ppk基因和质粒p1酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p2；

（3）设计引物，扩增含有烟草叶绿体rrn16基因强启动子和大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列；

（4）将含有烟草叶绿体rrn16基因强启动子和大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列和质粒pET28a酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p3；

（5）以质粒p2为模板，设计引物，扩增人工操纵子merT-merP-merB1-merB2-ppk；将merT-merP-merB1-merB2-ppk和质粒p3酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒，命名为p4；

（6）以烟草叶绿体DNA为模板，设计引物，扩增rps163’端非编码区基因序列；将rps163’端非编码区基因与质粒p4酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆过夜培养，提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期相符的质粒即为用于清除工业废水汞污染的重组质粒。

4.一种用于清除工业废水汞污染的重组工程菌，其特征在于，所述重组质粒是在质粒pET28a的基础上插入烟草叶绿体rrn16基因强启动子、大肠杆菌T7噬菌体基因10的5’UTR序列中的核糖体结合位点保守序列、烟草叶绿体rps16基因的3’端非编码区、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）聚磷激酶基因ppk和假单胞菌（Pseudomonas）K-62菌株去掉merA、merG后的mer操纵子构建而成。

5.根据权利要求4所述的用于清除工业废水汞污染的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌的宿主为大肠杆菌BL21。

6.一种如权利要求4所述的重组工程菌在清除工业废水汞污染方面的应用。