[发明专利]一种双光子显微镜

说明书

技术领域

本发明涉及光学技术领域，具体涉及一种双光子显微镜。

背景技术

在生物活体组织荧光成像领域中，双光子显微镜已成为一种必不可少的成像工具。相比单光子技术而言，其最重要的一个优点是能够对组织样品进行高分辨成像。由于双光子显微镜对散射生物样品具有亚细胞的分辨率，使得该种显微镜成为目前最受欢迎的显微成像技术之一，然而，目前该种显微镜的探测深度受限。随着成像深度的增加，由于样品组织对光的吸收和散射作用，入射激光功率会呈现指数的衰减，使得焦点处的信号减弱，非焦点处的噪声增强，从而导致成像的信噪比（即焦点处的信号与焦点外的噪声的比值）变差。经过某一特定深度后，焦点外的背景噪声最终会超过焦点信号，此时无法再分辨信号与噪声，这个深度即为该成像装置的极限探测深度。因此，提高成像信噪比是增加探测深度的关键。

现有技术之一是利用宽场脉冲场在样品中传播时，其脉冲周期随深度的增加而改变的特性，使脉冲在到达焦平面时具有最短的脉冲周期，从而在焦平面产生较强的信号并同时抑制了焦平面以外的背景噪声。该技术实现了带有光学切片(optical section)能力的宽场双光子显微成像功能，提高了双光子显微成像的速度。但是，由于组织的散射作用，这种宽场成像（面扫描）技术相比普通点扫描的双光子显微镜来说，其空间分辨随着成像深度的恶化程度更严重，所以这种技术并不能真正的增加成像深度。

现有技术之二是借助双棱镜光栅实现入射光脉冲在X-Z平面进行时间聚焦，而在与之相垂直的Y-Z平面实现空间聚集，从而使光脉冲在成像焦平面处形成经过时间聚焦的线，该种成像方法配合扫描振镜可以实现二维双光子显微成像。这种技术虽然可在一定程度上提高成像深度，但是只能将入射光脉冲聚焦成一条线，然后通过线扫描的方式来获得图像，这样的设计不可避免地降低了图像的横向分辨率，造成图像的模糊，所以对实际成像深度的提高非常有限。

发明内容

本发明实施例公开了一种双光子显微镜，能够对样品进行空间和时间同时聚焦的点扫描成像，增加成像探测深度。

本发明实施例提供一种双光子显微镜，所述显微镜包括第一分光元件、第二分光元件、反射元件、第一透镜、第二透镜、第三透镜、二向色镜、物镜、载物台和光电倍增管，其中：

入射脉冲光束在依次经过所述第一分光元件和第二分光元件后入射到所述反射元件上，并在由所述反射元件反射后依次经过所述第一透镜、第二透镜、二向色镜和物镜入射到所述载物台；

所述入射脉冲光束在所述载物台上的样品上激发的荧光由所述物镜收集后射向所述二向色镜，并由所述二向色镜反射后经过所述第三透镜射向所述光电倍增管。

在上述双光子显微镜中，所述第一分光元件和第二分光元件分别为光栅，所述第一分光元件和第二分光元件相对错开平行设置，以使所述入射脉冲光束在依次经过所述第一分光元件和第二分光元件后产生分光，形成衍射平行脉冲光束。

在上述双光子显微镜中，所述第一分光元件和第二分光元件分别为分光棱镜，所述第一分光元件的一边和第二分光元件的一个边相对平行设置，以使所述入射脉冲光束在依次经过所述第一分光元件和第二分光元件后产生分光，形成衍射平行脉冲光束。

在上述双光子显微镜中，所述反射元件为振镜。

在上述双光子显微镜中，所述物镜为可沿着入射光路移动的移动物镜。

在上述双光子显微镜中，所述反射元件为固定的反射镜。

在上述双光子显微镜中，所述载物台为三维平移台。

在上述双光子显微镜中，所述第一透镜为扫描透镜。

在上述双光子显微镜中，所述第二物镜为镜筒透镜。

在上述双光子显微镜中，所述第三物镜为收集透镜。