[发明专利]一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

沙门氏菌（Salmonella）是一种全球性的食源性致病菌。生物学上沙门氏菌是一类两端钝圆的革兰氏阴性菌，无芽孢，一般无荚膜，主要抗原有O抗原、H抗原、Vi抗原。动物性食品如禽肉、蛋类、乳品容易污染沙门氏菌。人体摄入含菌食物后会引起急性肠胃炎、伤寒，免疫力低下的儿童等人群中甚至出现败血症等症状。

沙门氏菌有2000多种血清型，临床中常见的血清型主要是肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌等。良好规范的生产操作过程和危害分析与关键点控制（HACCP）等管理体系的应用可以很大程度上减少食源性致病菌的发生。然而对原料和生产过程、产品的质量监测也是保障食品生物安全的重要过程。

目前检测沙门氏菌的方法主要有培养法、免疫学检测方法、分子检测方法。传统的生化培养法是检测沙门氏菌的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要5-10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；分子检测方法是基于沙门氏菌脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶链式反应（PCR）建立起来的。目前发展为传统PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。与传统PCR相比，RT-PCR具有实现定量检测目标DNA、特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。LAMP方法具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方面不亚于常规PCR技术，不依赖专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR。然而，有文献报道LAMP方法在检测牛乳中的沙门氏菌时，会出现假阴性的问题。这可能是与引物受到样品基质影响所引起的。同样常规PCR和实时PCR也面临着检测成本高、对操作人员技术要求较高的问题。

免疫学检测方法主要有酶联免疫反应（ELISA）、免疫层析试纸条（Immuno chromatographic test strip）。ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点成为食源性致病菌的常规检测方法。抗体的亲和力、交叉反应、稳定性对于ELISA方法的灵敏度和特异性有着关键性的决定作用。虽然胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，但一般而言，ELISA比胶体金试纸条具有更好的灵敏度，而且更适合高通量检测，因此ELISA也具有相当广泛的应用空间。

  作为食品安全事件中常见的致病血清型，鼠伤寒沙门氏菌的检测也是非常重要的。本发明首次采用LPS和菌体混合免疫的方法，成功制备了高灵敏的鼠伤寒沙门氏菌LPS的单克隆抗体并应用一株单克隆抗体就实现了鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法检测。成功制备抗体与采用的免疫原是密不可分的，单纯的通过菌体免疫制备沙门氏菌的单克隆抗体是比较困难的。作为沙门氏菌的主要抗原，LPS是有潜力的检测抗原，但LPS的免疫原性较弱，在小鼠体内很难引起足够的免疫应答。而沙门氏菌菌体表面均匀分布着大量的LPS，因此我们将鼠伤寒沙门氏菌LPS和鼠伤寒沙门氏菌菌体混合免疫取得了较好的效果。应用一个单克隆抗体即可实现高灵敏的双抗体夹心法检测这是与抗体较高的亲和力以及沙门氏菌表面分布大量LPS所决定的。

发明内容

(一)要解决的技术问题

  本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的批量、快速检测。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明的技术方案：一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法，步骤为：

（1）鼠伤寒沙门氏菌LPS单克隆抗体的制备