[发明专利]高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用

说明书

技术领域

本发明属于合成生物学及工业生物学技术领域，具体地，本发明涉及一种高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用。

背景技术

合成生物学是基于理性的设计，将标准化的生物元件进行集成与装配，从而构建性能优良的人造生命系统。合成生物学一经诞生，它的思想和设计就深刻地影响着工业微生物技术的发展，使微生物技术在药物，生物燃料，精细化学品的开发与生产过程中发挥出更加巨大的作用。

美国加州大学伯克利分校的Keasling实验室，将黄花蒿来源的紫槐二烯合成酶基因(ads)，紫槐二烯氧化酶基因(cyp71av1)以及细胞色素P450还原蛋白基因(cpr)置于酵母细胞调控元件下，最终在酵母工程菌中组装了一条青蒿酸的异源合成途径并成功地合成了青蒿酸。随后，麻省理工学院和塔夫茨大学的合作者在大肠杆菌中重建了紫杉醇前体-紫杉二烯的合成途径，结合对工程菌株的一系列改造，最终使得紫杉二烯的产量超过了1g/L。这些研究表明结合合成生物学的设计以及成熟的微生物基因工程技术，可以打破了种属的界限，实现各种来源珍稀化合物在通用微生物底盘细胞中的高效合成。

萜类化合物是种类最多，结构最丰富，功能最多样的天然产物，是药物，芳香物质，食品添加剂，橡胶以及生物燃料的重要来源。目前已被发现的萜类化合物超过40,000种，它们广泛地存在于植物中，同时真菌和细菌中也有越来越多的萜类化合物被报道。萜类化合物由通用的异戊酰焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)前体单元(C5)通过次序叠加合成。根据叠加的前体单元数量不同，分为半萜(C5)，单萜(C10)，倍半萜(C15)，二萜(C20)，三萜(C20)，四萜(C40)，多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物等。越来越多的萜类化合物被发现具有治疗和防控多种疾病的功能，比如抗癌，抗微生物，抗真菌，抗寄生虫，抗病毒，抗炎，免疫调节等。但这些化合物在原产植株或微生物中的合成往往受到严格的调控，含量低，且具有明显的季节性，严重地制约了进一步的开发利用。以太平洋红豆杉来源的紫杉醇为例，作为有效的抗药药物，该化合物非常微量地分布在太平洋红豆杉的树皮中，1200kg的树皮只能提取10g纯的紫杉醇。

在传统的模式微生物中，大肠杆菌是一种常用的异源合成底盘细胞。它具有清晰的遗传背景、成熟的基因操作技术与工具、丰富的基因表达元件，可靠经济的大规模发酵技术。大肠杆菌采用2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前体途径合成IPP/DMAPP前体单元，但原始大肠杆菌细胞的MEP途径只有极低的表达水平，仅能维持很低的前体供应，无法满足萜类化合物的高效合成。Yuan等人用染色体工程的方法，采用T5启动子替换MEP途径相关基因的原始启动子，以逐个强化MEP途径基因，并鉴定了途径中的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)，4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤藓糖醇合成酶基因(ispD)，2-甲基赤藓糖醇-2，4-环焦磷酸合成酶基因(ispF)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(idi)是限速步骤，共同强化这四个基因的表达，能够有效改善番茄红素的合成。基于Yuan等研究结果，MIT的研究人员将大肠杆菌内源dxs，ispD，ispF，idi基因串联成一个操纵子，并结合启动子工程，基因拷贝数调节等手段，最终获得工程菌经补料分批发酵后获得了>1g/L的紫杉二烯。这一系列对MEP途径的改造，虽取得了很大的成功，但是获得的底盘细胞仍无法满足萜类化合物大规模生产的要求。而且针对大肠杆菌内源MEP途径调控机制及酶学特性仍缺乏足够的了解，仅仅依赖某些限速步骤基因表达的强化无法彻底地解除途径中可能存在的未知调控，因此也就无法完全打开MEP途径的代谢通量并实现更高产萜类化合物底盘细胞的构建。

因此，本领域目前还没有一种有效的可靠的合成生物学与工业微生物技术，大规模生产萜类化合物。因此迫切需要构建能够异源合成萜类化合物的重组微生物工程菌，从而实现廉价，全天候，大规模生产萜类化合物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种底盘细胞，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。

在另一优选例中，所述的底盘细胞是用于生产萜类化合物的底盘细胞，并且所述的基因是选自下述的至少一个基因或其组合：

来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs2、idi、dxr、或ispD基因；