[发明专利]一种具有协同清除自由基作用的化合物组合

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种具有协同清除自由基作用的化合物组合，属于保健食品开发领域。

（二）背景技术

人口老龄化社会的形成使衰老相关性疾病如心血管病、帕金森症、阿尔海默症等的发病率逐年增加，一些老年人易发的癌症等慢性疾病近年也呈年轻化趋势，给国家和人民均造成了极大的医疗负担。研究发现，预防和改善亚健康状态是是防止和减轻以上疾病发生的重要途径，其中通过饮食调节则是较为重要和经济的方法之一。目前，许多研究已证实氧化胁迫直接或间接与各种疾病密切相关，同时应激介导的氧化胁迫也被认为是亚健康状态的初始阶段。因此,寻找一些天然安全的抗氧化物添加于食品是减轻氧化胁迫、预防亚健康状态的重要途径。

我国中药资源丰富，是天然抗氧化剂的重要来源，研究开发中药源功能食品已成为我国食品研究的热点和发展趋势。中医理论体系讲究配伍复方的应用，各药配伍后可起到协同或拮抗的作用从而对机体进行整体调节，表现出减毒、增效甚至产生单味药不具备的药理活性。目前从中药中筛选抗氧化活性成分大多以单味中药为材料，以获得单一抗氧化成分为目标，很少从复方中药的角度对多种抗氧化成分的协同作用进行研究。

黄芪和升麻均属于药食兼用型草药，黄芪是常用的补气药，有保肝、利尿、降血压及延缓衰老等功效，升麻常用于清热解毒、抗炎症、减缓疼痛。在中医治疗中，医生凭借经验经常把两药配对使用，从而取得更好的疗效，但这种协同作用背后的活性成分和作用机制仍不明确。因此从这两种草药中筛选出协同抗氧化成分对开发与氧化胁迫相关的功能食品和获得新型复合抗氧化剂等方面具有重要的理论价值。

（三）发明内容

本发明采用DPPH自由基清除实验对分离样品进行活性跟踪，采用基于中值效应原理的剂量-效应分析法对抗氧化成分的协同效果（组合系数，CI）进行评价，采用提取、萃取、柱层析、HPLC、HPLC-MS联用等方法对潜在的协同抗氧化成分进行分离和鉴定，从黄芪和升麻中筛选出一组协同清除DPPH自由基的化合物：毛蕊异黄酮和异阿魏酸（表1）。

将相同浓度的毛蕊异黄酮甲醇溶液和异阿魏酸甲醇溶液分别按体积比3:1；2:1；1:1；1:2；1:3配在一起，评价其协同清除DPPH自由基的能力（表2），发现相同浓度的毛蕊异黄酮甲醇溶液和异阿魏酸甲醇溶液在体积比1:1的条件下组合能表现出最好的协同增效作用（CI₅₀,0.770）。

表1各标准物质及其组合的DPPH自由基清除能力和协同作用

注：^a表示未检测到。

EC₅₀指自由基清除率为50%时所需样品的浓度，浓度越小，清除能力越强；CI₅₀指清除率为50%时的组合系数值（CI）。CI值≤0.9时，表示协同作用，CI值越小，协同作用越强；0.9<CI<1.1时表示加和作用；CI值≥1.1时，表示拮抗作用，CI值越大，拮抗作用越强。

表2异阿魏酸和毛蕊异黄酮不同比例组合清除DPPH自由基的CI拟合值

注：A:异阿魏酸，B：毛蕊异黄酮

CI₅₀指清除率为50%时的组合系数值（CI）。CI值≤0.9时，表示协同作用，CI值越小，协同作用越强；0.9<CI<1.1时表示加和作用；CI值≥1.1时，表示拮抗作用，CI值越大，拮抗作用越强。

（四）附图说明

图1：协同组合筛选流程图。

图1中的1是提取；2是分离；3是筛选协同清除自由基组分；4是活性成分鉴定；5是剂量效应评价。

（五）具体实施方式

（1）黄芪、升麻协同清除DPPH自由基的溶剂萃取物的筛选：黄芪药粉用体积分数为85%～95%的乙醇加热回流提取，旋转蒸发浓缩至浸膏。加入与浸膏等质量的去离子水制成悬浮液，置于分液漏斗中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行分步萃取，收集各溶剂萃取液浓缩至浸膏后分别得到黄芪的石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。升麻药粉同样采用上述方法提取和萃取得到升麻石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。通过测定黄芪的4种萃取物和升麻的4种萃取物的DPPH自由基清除能力以及黄芪萃取物和升麻萃取物交互组合（两药在浓度相同的条件下按体积比1:1组合）时协同清除DPPH自由基能力筛选出黄芪氯仿萃取物和升麻氯仿萃取物进行下一步的分离分析。