[发明专利]表达白喉毒素A片段的慢病毒载体系统及其制备与应用

权利要求书

1.表达白喉毒素A片段的慢病毒载体系统，其特征在于：将整合酶D64突变为A的PMDL-D64A、REV、VSVG和表达载体共转入过量表达突变EF-2的293T细胞，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体系统；

所述的表达载体包括pPRIME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-XRCC5p-RFP-2A-DTA-FF3；

所述的慢病毒载体系统是一种组成型和肿瘤细胞特异型启动子驱动的白喉毒素A片段的非整合慢病毒载体系统。

2.根据权利要求1所述的表达白喉毒素A片段的慢病毒载体系统，其特征在于：所述的慢病毒载体系统是利用CMV启动子或XRCC5启动子驱动白喉毒素A片段和荧光蛋白协同表达，其出发载体为pPRIME-CMV-GFP-FF3。

3.根据权利要求1所述的表达白喉毒素A片段的慢病毒载体系统，其特征在于：所述的表达载体能协同表达双顺反子GFP/RFP和DTA，其中由CMV驱动的慢病毒表达载体作为阳性对照，而XRCC5启动子驱动的表达载体为靶向肿瘤基因治疗的慢病毒载体。

4.根据权利要求1所述的表达白喉毒素A片段的慢病毒载体系统，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

步骤1）荧光蛋白基因的克隆：以pPRIME-CMV-GFP-FF3或pPRIME-CMV-dsRed-FF3质粒为模板，高保真PCR扩增GFP和RFP基因，并克隆入T/A克隆载体；

步骤2）DTA克隆：以pBSDTA-II的质粒为模板，高保真PCR克隆DTA片段，PCR产物以ApaI和NotI酶按双酶切连接方法克隆入步骤1）的T/A克隆载体中，获得GFP/RFP-DTA的T/A克隆载体；

步骤3）口蹄疫病毒2A序列的设计和合成：根据合成的核苷酸翻译后对应的2A短肽氨基酸序列，设计寡核苷酸片段，通过退火，连接插入步骤2）中获得的T/A克隆载体的GFP/RFP和DTA之间，获得GFP/RFP-2A-DTA的T/A克隆载体；

步骤4）启动子克隆：以提取的293T细胞基因组DNA为模板，高保真PCR克隆基因启动子，PCR产物以ApaI和NheI酶按双酶切连接方法克隆入用同种内切酶酶切形成的线性pPRIME-CMV-GFP-FF3慢病毒载体，连接形成pPRIME-XRCC5p-GFP-FF3表达载体； 

步骤5）利用酶切连接方法将GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆载体中的GFP/RFP-2A-DTA片段分别转移入pPRIME-CMV-GFP-FF3或pPRIME-XRCC5p-GFP-FF3慢病毒表达载体，获得pPRIME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3或pPRIME-XRCC5p-RFP-2A-DTA-FF3；

步骤6）EF-2基因的克隆：以293T细胞的RNA反转录形成的cDNA为模板，高保真PCR扩增EF-2基因；

步骤7）EF-2 717位氨基酸的突变和慢病毒载体的构建：利用重叠PCR的方法，将EF-2的717位甘氨酸GGA定点突变为精氨酸CGA，以步骤6）中的扩增产物为模板进行高保真PCR扩增，再以EcoRI和BamHI酶按双酶切连接方法将PCR突变产物插入至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体，形成pCDH-CMV-mEF-2-EF1-Puro；

步骤8）稳定表达突变EF-2的细胞系的建立：将包装好的pCDH-CMV-mEF-2-EF1-Puro，与PHR、VSVG载体按比例共转入293T细胞系，收集病毒上清液进行细胞感染，再利用1.5μg/ml嘌呤霉素对感染细胞进行筛选，获得突变EF-2过量表达的293T细胞系；

步骤9）慢病毒的包装：在转染前对293T细胞进行无血清饥饿2小时，将位于整合酶D64突变为A的PMDL-D64A、REV、VSVG和步骤5）中的慢病毒表达载体混匀后，再与自制的PEI转染试剂混匀，共同加入步骤8）中过量表达突变EF-2的293T包装细胞中，6小时后将培养基替换为含体积分数为2%血清的培养基，连续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得非整合型的pPRIME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3或pPRIME-XRCC5p-RFP-2A-DTA-FF3慢病毒。