[发明专利]一种产白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法，属于合成生物学和代谢工程领域。

背景技术

白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，又称为芪三酚，是肿瘤的化学预防剂，是降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂，对心血管疾病和癌症具有有益作用，对激素依赖性肿瘤有明显的预防作用。还可对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症有预防作用，具有抗病毒及免疫调节作用。对人体内部一种单体抗衰老酶起作用，进而发挥预防各种年龄相关疾病。

由于白藜芦醇具有多种生物和药理活性，使其广泛应用于食品、医药、保健品、化妆品等领域。白藜芦醇具有优良药理活性和保健功能其市场需求很大且与日剧增，目前已有大部分国家和地区都开发了白藜芦醇及其制品。美国已把白藜芦醇作为膳食补充剂，日本已将从植物提取的白藜芦醇作为食品添加剂，中国已将含白藜芦醇的植物提取物制成降脂美容的天然保健食品，因此白黎芦醇的发展前景十分广阔。

目前，工业上生产白藜芦醇主要采用植物提取的方法，但是如何从植物复杂的提取液中得到所需要的高纯度白藜芦醇仍然是人类无法解决的一个技术难题，而高污染、使用有毒和有害化学试剂、以及白藜芦醇的复杂结构等因素限制了化学法的使用，正因如此，微生物发酵法以使用廉价无污染的原料、较低的污染的排放、较低的能源需求等优点受到越来越多的关注。目前国内外关于微生物发酵法生产白藜芦醇的研究都需要在发酵液添加价格昂贵的前体物质香豆酸，难以应用于大规模的工业生产。另外目前的发酵法都采用的是两步法生产，即菌株首先在营养丰富的培养基中生长，在达到一定菌浓的时候，通过离心等方法收集所有的菌体置于基本培养基中发酵，显然这种发酵方式无法应用于大规模工业化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种以酪氨酸为底物直接合成白藜芦醇的基因工程菌株，是在Escherichia coli(BL21)中共表达了3个质粒：pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-STS，pACYCD-matB-matC。

所述pCDF-RgTAL-Pc4CL是携带编码酪氨酸脱氨酶TAL的基因和4-香桂酸：辅酶A连接酶4CL的基因的pCDFDuet-1，所述pET-STS是携带编码芪合酶STS基因的pETDuet-1，所述pACYCD-matB-matC是携带编码丙二酸转运、丙二酸吸收酶的基因matB、matC的pACYCDuet-1。所述pCDFDuet-1采用启动子Trc，质粒拷贝数为20；所述pETDuet-1采用启动子为T7，质粒拷贝数为40；所述pACYCDuet-1采用启动子T7，质粒拷贝数为10。

编码所述丙二酸转运酶的基因matB核苷酸序列如SEQ ID NO.1，所述丙二酸吸收酶的基因matC核苷酸序列如SEQ ID NO.2，编码所述酪氨酸脱氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ IDNO.3，编码所述4-香桂酸：辅酶A连接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4，编码所述芪合酶STS的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

构建含有所述途径的基因工程菌的方法主要包括以下内容：

（1）采用全基因合成方法获得途径所需要的五个基因，

（2）通过酶切连接构建得到三个共表达质粒pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-STS，pACYCD-matB-matC；

（3）挑选能在含有100ug/mL的氨苄、35ug/mL的氯霉素、50ug/mL的链霉素等三种抗生素LB平板上生长的菌落，使其在含上述的三种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子，进一步PCR测序验证五个途径基因已成功转入到Escherichia coli(BL21)中。

利用含有所述合成途径的Escherichia coli(BL21)重组菌发酵生产白藜芦醇的方法：

（1）MOPS培养基(g/L)：葡萄糖5，氯化铵9.1，磷酸氢二钾0.3，丙二酸2，MOPS83.7，N-{三（羧甲基）甲基}甘氨酸7.1668，硫酸铁0.03，硫酸钾0.5，氯化镁1.1，氯化钠29.2，微量元素（ATCC BAA-232的配方）10ml,，自来水定容至1L。MOPS培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。维生素等热敏性材料配制后0.22μm膜过滤除菌，接种前加入。