[发明专利]一种检测赭曲霉毒素A的试纸条及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测赭曲霉毒素A的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测赭曲霉毒素A的胶体金试纸条，其特别适用于黄豆、玉米等谷物及饲料（原料、配合料、浓缩料）中赭曲霉毒素A残留的检测。

背景技术

赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素A主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。OA产生菌广泛分布于自然界，对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁。我国对配合饲料和玉米中OA的允许量为≤100μg/kg，谷类和豆类的限量≤5μg/kg。

目前检测粮食和饲料中OA的仪器方法有液相色谱、气相色谱、质谱和毛细管电泳法等，这些方法灵敏度较高，结果稳定，但所需仪器设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的现场筛选，限制了其应用。因此，针对现有赭曲霉毒素A检测技术上的不足，我们设计了一种用胶体金免疫层析技术检测黄豆、玉米等谷物及饲料（原料、配合料、浓缩料）赭曲霉毒素A的方法，该方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的赭曲霉毒素A残留检测试纸条。

本发明所提供的检测赭曲霉毒素A残留的试纸条，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7）；所述反应膜上具有包被有赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物。

所述赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物是由赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述赭曲霉毒素A单克隆抗体是以赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由赭曲霉毒素A单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

所述样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）依次粘贴在底板（7）上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1）制备喷涂有赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：将赭曲霉毒素A与对苯二胺反应得到赭曲霉毒素A半抗原；

2）将赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联，得到赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到赭曲霉毒素A单克隆杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将步骤3）制备的赭曲霉毒素A单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物；

7）将赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；

8）将赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；

9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。