[发明专利]一种山参发根及其培育方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种山参发根及其培育方法，开辟了一个山参开发利用的新途径，为山参发根生产天然药物提供了可能，属于生物技术领域。

背景技术

发根农杆菌A₄具有转移其Ri质粒上的rol基因，能诱导药用植物产生发状根，该发根能在液体培养基内快速生长，并表达药用植物的有效药用成分。山参(Mountain PanaxGinseng C.A.Meyer)根内含有人参皂苷较多，有些特殊人参皂苷仅在山参中存在，具抗癌作用，用量极微就有很好的疗效。

目前，国内主要是从山参参根内提取人参皂苷供药用。但天然资源受气候的影响，季节性强，病虫害等也会严重影响山参的产量和质量；扩大山参的种植，必定与粮争地，而我国的土地资源十分有限；而且，山参入药需15年以上的时间，其根头小，单产低，严重制约山参在生产上的应用。近30年来，随着生物技术的发展，利用发根农杆菌诱导药用植物产生发根，并利用发根来生产药用植物有效成分研究得越来越深入，这是因为其有以下优点：第一，天然山参资源有限；第二，山参中有无法替代的、特效的、高经济价值的药用成分，第三，可以实现山参中有效药用成分的室内可控生产。

    目前国内外均未见转化山参发根成功的报道。

发明内容   

本发明提供一种山参发根，解决了人工种植山参生长周期长、繁殖速度慢，遗传上不够稳定等不利因素，实现了室内生产山参。

本发明还公开了上述山参发根的培育方法，以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根。

本发明提供的山参发根，又称之为发根（hairy root）；其特征在于：

以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起山参发根悬浮培养无性系。

本发明公开的山参发根的制备方法，其技术解决方案如下：

以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根。每一根山参发根即为一个单克隆，经过继代培养和多次筛选，逐步建立起山参悬浮培养无性系。

具体步骤如下：

1、外植体的预培养：

取山参新鲜、健康的根或茎或叶片，洗净；用0.1%的升汞灭菌10min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，然后吸干表面水分；再于超净台上将外植体切成0.5cm×1.0cm大小，转移到已灭菌的1/2MS固体培养基上（每瓶5片）；于黑暗条件下预培养2~7d。

2、发根农杆菌的制备：

挑取发根农杆菌单菌落，接种于5mL液体YEB内，28℃黑暗条件下振荡培养过夜，于次日接种到50ml液体YEB中继培养4~6h后备用。

3、山参叶片与发根农杆菌共培养转化：将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根农杆菌菌液中，感染5~10 min，然后，用无菌滤纸将菌液吸净；再接种于含抗生素1/2MS固体培养基上，约经过30d~50d培养生出发根。

4、发根培养：

去菌培养：切割下由外植体上长出的发根，置于含抗生素（头孢噻吩300~500mg/L）1/2MS固体培养基上，进行去菌培养，每3~5d转继代1次，进行3~5次；

扩大培养：将无菌的发根1.0g移入盛有50mL 1/2MS液体培养基的100mL三角瓶内，于黑暗条件下，室温22℃~25℃，110rpm，悬浮培养。

山参发根无性系的建立：经3~5代的悬浮培养，按发根克隆的来源分别建立不同的无性系。

此外，利用本发明的山参发根产生的愈伤组织，还可筛选出细胞悬浮培养无性系。

本发明与山参栽培根相比的积极效果在于：