[发明专利]一种犬的细管冷冻精液制作方法及应用

说明书

技术领域：

本发明涉及犬的细管冷冻精液制作方法。

背景技术：

犬人工授精，技术是一种代替犬自然交配的繁殖技术，是在人工辅助下，采集种犬精液、经过品质检测和稀释保存等处理，再将精液输送到母犬生殖道内，使母犬受孕的配种技术。精液冷冻，技术是指将采集到的新鲜精液，经过特殊处理后，利用液氮（—196℃）、干冰（—79℃）或其他冷源，以冻结形式长期保存精液的技术。目前在世界许多发达国家，犬的AI与精液冷冻研究已经得到广泛开展，并运用于实际生产中,而在国内也有人进行过研究；影响犬冻精人工授精成败的因素众多，本文主要从精液采集、评估、稀释、保存（包括冷藏保存、冷冻保存，以及解冻）和输精等方面对国内外犬的AI与精液冷冻研究进行综述。

发明内容：

犬是人类最早驯养的动物之一，与人类生活密切相关，很早就被作为人类的宠物饲养，通过良好的训练，能为人类提供良好的服务，替人类完成无法完成的任务或辅助人类更好地完成工作任务，尤其在军警、导盲、生命探测、辅助边防检查和搜救等特殊需要的领域中，其应用价值巨大。犬细管冷冻精液（以下简称冻精）是指将采集到的犬的新鲜精液，经过质量检验，稀释等处理后，把精液封装在微型（0.25ml)塑料细管内，利用液氮为冷源，按特定的程序和冷冻速度进行冷冻，使精液以冻结的形式保存于超低温环境下，达到长期保存犬精液的目的。犬细管冻精的制作和使用，有利于提高优秀种公犬的利用率和异地基因交流，降低运输成本和防止疾病的传播以及种犬遗传物质的保存。

具体实施方式：

1.犬细管冻精制作设备：相差显微镜，分光光度计，普通离心机，MRS-3自动分装机，广口液氮生物容器，液氮，微型塑料细管，拇指管，电冰箱，低温操作柜，细管冷冻架，玻片，量筒，量杯，刻度集精试管，恒温水浴锅，移液器和稀释液等。

2.种公犬的选择和采精，用于制作细管冻精的公犬必须谱系清楚，血统纯正，品种特征明显，工作表现突出，易于训练、驯服，服从口令，忠于训导者。符合采精要求的公犬用手淫法采精，采精时一人保定好公犬，防止攻击采精员，采精员用1~3‰的高锰酸钾溶液清洗消毒公犬外阴后，一手握住公犬阴茎根部并反复按摩球状膨大部，一手持集精试管，待公犬阴茎勃起开始排除第一部分精液时，准备及时用集精试管收集第二部分富含精子的精液，第三部分精液随后排出，该部分精液和第一部分精液均不收集（含精子数量极少），只收即第二部分精液用于制作细管冻精。

3.稀释液的配制：准确称取所需试剂后混合、溶解、过滤和消毒待用。

4.犬精液的处理：对所采集的精液记录犬号或名字，用离心试管测量采精量，用血球计数板或分光光度计测定精子密度，用相差显微镜测定原精活力。

5.犬精液的稀释和分装：精子密度2亿/ml以上,原精活力60%以上的犬精液用预先配制的冷冻稀释液稀释，使每剂量有效精子数达到1200～1500万个即可；稀释后的犬精液用MRS-3自动分装机在实验室室温下分装在微型塑料细管内，封口和印字。

6.犬精液的平衡：分装、封口和印字的犬细管精液放置于+4℃的温度下 平衡4小时。

7.犬精液的冷冻和解冻：平衡后的犬细管精液在+4℃左右温度下整齐放在细管冷冻架上，然后把细管冷冻架和精液放入-110～-130的液氮蒸汽中冷冻10～15分钟，冷冻后的犬细管冻精浸入液氮保存；随机抽取1～2支犬细管冻精立即放入40±2℃的水浴中解冻10秒左右，检查解冻活力，解冻活力可达35%以上，顶体完整率40%左右，解冻活力35%以上的犬细管冻精包装于液氮中长期保存。