[发明专利]肝纤维化治疗方法

说明书

技术领域

本发明属于肝纤维化治疗领域。具体地，本发明涉及通过抑制哺乳动物S100A4基因的表达来治疗所述哺乳动物的肝纤维化。

背景技术

肝纤维化是指肝脏中细胞外基质成分的大量沉积，它是一种对肝脏慢性损伤的修复反应¹。肝纤维化是各种慢性肝病发展成肝硬化的必经阶段，由于肝硬化是肝脏实质性病变，医学界普遍认为较难逆转，在治疗上除肝脏移植外，缺乏其它有效措施²。近年来，随着医学分子生物学技术的应用，人们对肝纤维化发生的机制进行了广泛而深入的讨论，明确提出了肝纤维化可以逆转的论点。因此，逆转肝纤维化的研究已成为世界医学攻关中的一个热点课题。

目前，国内外对于肝纤维化治疗的研究已经取得了一些成果。临床上常用的治疗肝纤维化的药物主要有干扰素、秋水仙碱、白介素-10等，但是这些药物的治疗效果有限，且副作用大，不宜长期使用。因此亟需肝纤维化治疗的新靶点和新方法。

S100A4是S100钙结合蛋白超家族中的一员，它在细胞质、细胞核以及胞外基质中均有分布³。S100A4在哺乳物种间的保守性很高，人S100A4(NCBI数据库编号：NP_002952)与小鼠S100A4(NCBI数据库编号：NP_035441)在氨基酸序列上的相似性高达93%。已有研究表明S100A4能通过多种途径促进肿瘤的转移，如促进肿瘤血管新生⁴、增强肿瘤细胞的运动性⁵以及上调胞外基质中金属蛋白酶的表达^6,7等。但是S100A4在治疗肝纤维化方面的作用至今还没有报道。

为了探讨新的肝纤维化治疗的方法，发明人进行了本发明。

发明内容

本发明提供了一种通过靶向S100A4分子治疗肝纤维化的方法。所述方法具体是通过RNA干扰沉默S100A4基因来治疗肝纤维化。

为了抑制S100A4的表达，本发明采用了RNA干扰技术。RNA干扰是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解⁸。其中短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构。

目前常用的体内RNA干扰方法是将干扰RNA序列作为“短发夹”克隆到质粒载体中，在体内该发夹序列被表达出来，形成一个双链RNA，并被双链RNA复合体降解为有效的小RNA分子。将双链RNA导入动物体内的方法主要包括：直接注射含RNA干扰序列的质粒、将含RNA干扰序列的质粒包装成腺病毒或逆转录病毒注射入体内、以及脂质体介导的体内转染等。

因此，靶向S100A4的RNA干扰可以通过直接注射含RNA干扰序列的质粒、将含RNA干扰序列的质粒包装成腺病毒或逆转录病毒注射入体内、以及脂质体介导的体内转染等方法来实现。

在本发明的一些实施方案中，采用腺病毒介导的RNA干扰。采用其他方式的RNA干扰同样可以实现本发明。

腺病毒是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。目前常用的应用于基因治疗的腺病毒多为复制缺陷型重组人V型腺病毒，删除了与腺病毒复制相关的E1和E3基因。尽管一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、呼吸系统或眼部的急性感染，但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介导的基因治疗不仅可以静脉注射，还可以通过口服经肠道吸收或通过喷雾、滴注经呼吸道吸收，使得基因治疗易于推广应用。腺病毒易于制备、纯化和浓缩，病毒滴度可以高达10¹¹pfu/ml。所以，腺病毒是目前基因治疗临床试验中应用最多的一种载体。

因此本发明采用腺病毒介导的RNA干扰技术抑制S100A4基因的表达。首先根据小鼠S100A4mRNA序列设计与其互补的shRNA序列，将其克隆到表达腺病毒载体中。进而利用AdEasy^TM系统重组出携带靶向S100A4shRNA的腺病毒，经氯化铯密度梯度离心纯化出腺病毒。纯化的腺病毒通过尾静脉注射的方式给予诱导肝纤维化的小鼠。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.用于抑制哺乳动物S100A4基因表达的试剂在制备用于治疗所述哺乳动物的肝纤维化的药物中的用途。