[发明专利]精确序列信息及修饰碱基位置确定的方法

说明书

本申请是申请日为2009年11月06日、申请号为200980125207.9、PCT申请号CN2009/074851、发明名称为“精确序列信息及修饰碱基位置确定的方法”的分案申请。

【发明所属的技术领域】

本案涉及确定核酸序列的方法及确定核酸中修饰碱基位置的方法。

【现有技术】

DNA测序技术的最近发展增加了在基因组层次上高度个人化、预防医学的可能性。而且由一个或多个族群中的多个个体快速获取大量的序列信息的可能性，可在生物医学科学上开辟基因组革命的新阶段。

基因型间的单一碱基差异可产生实质的表型效应。例如已有超过300个突变确认位于编码苯丙氨酸羟化酶(PAH)的基因中，该酶在苯丙氨酸代谢及蛋白质与神经递质的生物合成中，将苯丙氨酸(phenylalanine)转换为酪氨酸(tyrosine)，该突变造成酶活性丧失及高苯丙氨酸症(hyperphenylalaninaemia)及苯酮尿症(phenylketonuria)的疾病(如Jennings et al.,Eur J Hum Genet8,683-696(2000))。

序列信息可使用Sanger测序法获得，Sanger测序法中，标记的双脱氧基链终止序列(dideoxy chain terminator)的核苷酸类似物并入大量的引物延伸反应中，分开不同长度的产物并分析确定该并入的终止序列之相同性(如Sanger et al.,Proc Natl Acad Sci USA74,5463-5467(1997))。确实有许多基因组序列依此技术被确定。然而以Sanger测序获取序列信息的成本及速度受到限制。

新的测序技术可以每日数兆碱基的惊人速度产生序列信息，每一个碱基的成本低于Sanger测序(如Kato,Int J Clin Exp Med2,193-202(2009))。但是，使用这些测序技术所得的原始信息较传统的Sanger测序产生更多的错误。这是因为获得的信息来自于个体DNA分子，而非一个庞大的族群。

例如通过合成的单一分子测序中，因为装置错过一个微弱讯号、或者缺少来自荧光染料脱色的信号、或因为聚合酶作用太快以致未被装置检测到，可能会略过一个碱基。所有上述事件皆导致原始序列中的缺失错误。同样地，突变错误及插入错误也会因为潜在的较微弱信号及较传统方法快速的反应等简单原因，更高频率地发生。

低精确度的序列信息更难以组合(assemble)。在大规模测序中，例如测序一个完整的真核基因组，其DNA分子被切成较小片段。这些片段同时被测序，然后组合所得的读取，重新构筑原始样本DNA分子的完整序列。切成片段的过程可由例如机械性剪切或酶性切断所达成。

将序列的小读取组合成大的基因组需要片段的读取精确到足以正确地组合在一起。这对于由Sanger法产生的原始测序信息通常是正确的，Sanger法可具有超过95%的原始信息正确性。精确的单一分子测序技术可应用于检测核酸样本中的单一碱基修饰或突变。然而，因为上述的限制，单一分子测序技术的原始信息精确度可能降低。个别读取原始序列的精确度可低至60-80%(如Harris et al.,Science320:106-109(2008))。因此，提供精确的单一分子测序方法是有用的。

而且，DNA甲基化在基因表达调节中扮演关键角色，例如，启动子处的甲基化通常导致转录沉默(transcriptional silencing)。甲基化也已知是基因组印迹(genomic imprinting)及X染色体失活的必要机制。然而，辨识复杂的整个基因组甲基化概貌(profile)的过程受到限制。因此以高通量确认DNA甲基化概貌的方法是有用的，而且此方法也提供对序列的精确确认。

【发明内容】