[发明专利]鸡β-防御素AvBD6基因及其乳酸菌载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡β-防御素AvBD6基因及其乳酸菌载体的构建方法。 

背景技术

饲用抗生素一直以来广泛应用于降低畜禽类发病率和维持畜禽健康。然而，长期使用抗生素会导致其在畜产品中残留及产生细菌耐药性，并通过食物链威胁人类健康。因此，迫切需要寻找一种全新类型的抗菌物质来控制畜禽疾病、改善畜禽产品品质，以保证畜禽业健康快速的发展。防御素（Defensin）是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，根据半胱氨酸残基形成二硫键的分子结构不同，分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素三大类^[1，2]。禽防御素属于β-防御素的一种，具有抗菌谱广、抗菌机制特殊、无残留等特点，已成为很有前景的新一代“绿色抗生素替代品”^[3，4]。 

鸡AvBD6在鸡的先天防御系统中起着重要的作用，并在体内很多组织器官中广泛表达，其中在消化道上端、肝脏、胆囊和肾脏中的表达量较高，且具有广谱的抗菌活性^[5]。鸡AvBD6已经在大肠杆菌和毕赤酵母中成功表达，鸡AvBD6在大肠杆菌中表达的融合蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和大肠杆菌均有抑菌活性^[6]。而鸡AvBD6在毕赤酵母GS115中表达的融合蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均有抑菌活性^[7]。鸡AvBD6重组蛋白具有耐热和耐酸碱的特性，因此，可以耐受饲料 加工过程的高温处理与适应畜禽消化道内的pH环境。 

本发明尝试应用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)进行表达，因为乳酸乳球菌是公认的安全级(generally regarded as safe，GRAS)微生物，对动物生长具有益生作用，可直接口服，而不需要进一步纯化目标蛋白，可作为一种新型功能性微生态制剂，这将为微生态制剂的深层次开发作出有意义的探索。本发明采用乳酸菌表达系统中的NlCE系统，是因为其是在乳酸菌中应用最广、可控性强的高效诱导表达系统。在加入诱导物Nisin后其诱导效率可达1000倍以上^[8]。有研究报道表明，防御素和益生菌能够提高饲料转化率、促进营养物质的吸收，维持肠道微生态平衡，促进机体免疫功能，从而防治家禽疾病，提高家禽生产性能。 

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种鸡β-防御素AvBD6基因及其构建方法。 

本发明是通过以下技术方案来实现的。 

鸡β-防御素AvBD6基因，其序列如序列表所示。参照乳酸乳球菌密码子的偏爱性进行密码子优化处理，将稀有密码子agg、cgg、tgc等优化为偏爱密码子cgt、tgt，设计并合成后命名为Op-AvBD6。 

本发明要解决的技术问题之二是提供一种鸡β-防御素AvBD6基因乳酸菌表达载体的构建方法。 

本发明中载体pNZ8148-Op-AvBD6的构建表达方法是：用限制性酶NcoI和XbaI分别对载体pNZ8148和Op-AvBD6进行双酶切， 回收酶切产物，经DNA Ligation Kit连接后电转化到Lactococcus lactis NZ9000中，电转化处理参数为2.5kV、25μF、200Ω、5ms。经氯霉素筛选、PCR鉴定，双酶切鉴定后得到转化子pNZ8148-Op-AvBD6，提质粒送生物公司测序，测序结果完全吻合。 

对上述的乳酸菌表达载体进行诱导表达的方法是：将测序正确的阳性菌落接种于GM17液体培养基中，待菌液OD₆₀₀值达到0.4～0.5时加入Nisin（终浓度为5ng/ml），30℃诱导4h。诱导结束后离心收集菌体，将菌体用溶菌酶破碎后离心取上清液（含目的蛋白）。将pNZ8148空载体转化至L.lactis NZ9000中，按同样方法进行诱导表达，取4h后的诱导表达产物作为阴性对照。 

重组AvBD6乳酸菌，其保藏号：CGMCC No7831；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号；保藏日期：2013-06-27；分类命名：乳酸乳球菌；拉丁名：Lactococcus lactis。 

本发明的有益效果：