[发明专利]一种重组大肠杆菌利用甘油生产3-羟基丁酮的方法

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体地说将参与3-羟基丁酮生物合成的两个基因克隆并与大肠杆菌高拷贝载体pUC19连接，将重组质粒转入大肠杆菌中，使用氨苄青霉素作为筛选标记，以加强这两个基因在大肠杆菌中的表达量，使3-羟基丁酮可以在大肠杆菌中大量合成。 

背景技术：

3-羟基丁酮(acetoin)又名乙偶姻或甲基乙酰甲醇，广泛存在于自然界许多食物中，如玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等，由于其具有特有的奶油香味，因此多用于奶油、干酪、咖啡、坚果的香味增强剂，同时也可用于配制奶油、乳品、酸奶和草莓型香精等。另外，啤酒风味、奶酪香味均与3-羟基丁酮有关。3-羟基丁酮分子式C₄H₈O₂，分子量88.12，有两个手性异构体。化学结构式如下所示。(Budavari S.1996) 

3-羟基丁酮结构 

3-羟基丁酮单体为无色或淡黄色液体，有特殊的奶油香气，熔点为15℃，沸点为148℃，可自燃，易溶于水，可溶于乙醇、丙二醇，微溶于乙醚。3-羟基丁酮易聚合成二聚体，二聚体为白色结晶粉末。 

3-羟基丁酮生产方法主要包括化学合成法和生物转化法。化学合成主要采用两种方法：一种是通过丁二酮部分加氢还原；另一种是通过2，3-丁二醇选择性氧化。生物转化法，一种是利用酶法转化丁二酮生产，另外是通过微生物发酵糖质原料生产。无论是化学合成法还是生物转化法都是以丁二酮或2，3-丁二醇为原料，但是丁二酮和2，3-丁二醇以石油为原料的合成香料，而非大宗化工产品，因此原料来源及价格都受到限制，尤其是最近二十年来，上升的石油价格导致化学合成 法失去了优势，在能源需求不断扩大、化石能源日益短缺、石油资源供应不稳定的情况下，使得3-羟基丁酮的生产研究受到阻碍。近年来，以可再生的生物质资源为原料，经过生物发酵的方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物技术方法获得了人们的青睐。到较好研究开发。目前，生物转化法的研究热点都在于以糖质作为原料生产3-羟基丁酮，但是，粮食资源日益紧张的今天，开发以廉价的非粮糖质为原料发酵生产3-羟基丁酮具有很好的发展前景。(Studer M.，OkaforV.1998) 

目前的研究中，多以糖质为原料利用微生物发酵生产丁二酮和2，3-丁二醇，而3-羟基丁酮通常都是一种主要的副产物。目前的报道中，多粘杆菌可利用木聚糖生成丁二酮和3-羟基丁酮，其总产量最高可达11.3g／L，而乳酸菌发酵产生丁二酮和3-羟基丁酮，但是该菌株还产生大量的2，3-丁二醇。Teixeira R.M等人利用汉逊酵母发酵产3-羟基丁酮，产量最高可达0.36g/L，具有良好的发展前景(Hespell R.B.1996，Braneni A.L.，Keenan T.W.1971，TeixeiraR.M.，2002.)。但是这些已报道的菌种生产3-羟基丁酮都是以糖质资源为原料，由于粮食的短缺，导致以糖为底物的发酵生产前景堪忧，因此，我们使用了可以利用甘油的大肠杆菌作为生产菌株。大肠杆菌具有生物量较大，发酵周期短，生物背景明确，可以利用甘油这一非糖质底物等优点。由于现代工业在通过植物油和动物脂肪生产石油的过程中产生大量的废弃甘油，这些废弃甘油的比重高达10％，因此，使用大肠杆菌以甘油为底物生产3-羟基丁酮可以使原料成本降低，并且可以保护环境。 

发明内容

本发明的目的是获得一种使用甘油为底物高产3-羟基丁酮的大肠杆菌菌株的制备方法。本发明的另一目的是公开了高产3-羟基丁酮的基因工程菌的发酵方法。 

本发明以大肠杆菌BW25141(美国E. coli Genetic Resources at Yale，The Coli Genetic Stock Center)为出发菌株，将两个与合成3-羟基丁酮有关的基因通过大肠杆菌高拷贝载体pUC19(美国New England BioLabs公司)转入大肠杆菌中，从而获得高产3-羟基丁酮的基因工程菌ATN16133。得到的菌株可以用甘油作为碳源生产3-羟基丁酮。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的： 

一种使用甘油为底物高产3-羟基丁酮的大肠杆菌菌株的制备方法，其步骤如下： 

1)基因片段的克隆 

利用引物序列1 

GGGAAAGGTACCatgGACAAACAGTATCCGGTACGCC 

引物序列2 

GGGAAAGCATGCttaCAGAATCTGACTCAGATGCAGC