[发明专利]ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒

说明书

所属技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒。

背景技术

ABCB1转运蛋白家族是一类跨膜蛋白，其主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物等主动转出质膜，ABCB1基因在人类多药耐药基因族中起主导作用，其表达受各种因素的影响，属于可调控基因。研究显示与ABCB1的基因表达、蛋白结合能力影响较大的3个单核苷酸多态性分别为：rs1128503，rs2032582和rs1045642。ABCB1定位于人类7号染色体q21.1，由28个外显子组成，编码一个170kDa的跨膜糖蛋白-P糖蛋白。它是人体内重要的转运蛋白之一，在胃肠道、肝脏、肾脏、脑等重要组织器官广泛分布，参与多种药物的吸收、分布及分泌和排泄。

ABCB1是一种能量依赖性药物输出泵，当化疗药物靠浓度梯度到达细胞后与ABCB1蛋白结合，导致ATP结合区活化，此时其核苷酸结合位点与ATP结合，ATP随即水解为ADP释放能量，在Mg2+作用下使P糖蛋白形态发生变化，在药物尚未发生细胞毒作用之前被转移至细胞外，使细胞内药物浓度降低，于是作用到药物靶位细胞核位置的药物浓度相对降低而产生多药耐药。rs2032582是位于ABCB1外显子上第893位密码子上G到T／A突变，导致893位丙氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，生化分析证实这种突变会影响药物转运。GG野生型细胞内的铂类药物浓度高于突变型，导致细胞死亡和严重的中心粒细胞毒性。在美国前列腺癌人群中被发现该位点和rs1045642的多倍型与多西紫杉醇治疗的中性粒细胞毒性的显著相关。

氯吡格雷是一种新型噻吩吡啶类的抗血小板药物，氯吡格雷为药物前体，本身无活性，氯吡格雷约50％经胃肠道吸收后在肝脏内迅速代谢，血浆中原形药物浓度极低。氯吡格雷在小肠的吸收受到ABCB1基因编码的质子泵P糖蛋白调控。研究表明ABCB1基因rs1128503，rs2032582和rs1045642三者存在连锁不平衡关系含有两个ABCB1C3435T等位基因变异体可降低氯吡格雷的血药浓度。在对白种人中研究时发现携带3435TT突变型纯合子基因型个体的P糖蛋白的表达量比正常野生型个体低51％。FAST-MI研究显示携带两个ABCB1C3435T等位基因的患者比没有携带的主要终点事件(死亡，非致命性卒中、心肌梗死等)的风险高。在接受氯吡格雷治疗的患者中，ABCB13435C→T基因型与心血管死亡、心肌梗死及卒中等事件风险呈显著相关(P=0.0064)，与ABCB1基因型3435CT／CC携带者相比，纯合子TT携带者主要终点事件风险增加72％；在健康人群中，纯合子3435TT携带者应用氯吡格雷后血小板最大聚集率出现绝对降低，但降幅较CT／CC携带者减小7.3％(P=0.0127)。ABCB1基因型3435TT携带者降低了对血小板的抑制，且在氯吡格雷治疗期间复发性缺血事件的风险有所增加。

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，相对传统的Sanger测序法，焦磷酸测序更快、更简单，且便宜得多。焦磷酸测序方法由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram TM转化为一个峰值，其高度与核苷酸数目成正比。其操作简单，结果准确可靠，可以行大规模分析。

基于以上所述，本发明采用焦磷酸测序对ABCB1基因的三个多态性位点进行检测，对进行化疗的肿瘤患者或接受氯吡格雷治疗的患者提供个性化治疗方案提供决策依据。

发明内容

本发明的目的在于，提供一组用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503的核苷酸序列。

本发明的目的在于，提供一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs2032582的核苷酸序列。

本发明的目的在于，提供一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs1045642的核苷酸序列。

本发明的目的在于，提供一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs104564的焦磷酸测序方法及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序方法中使用的PCR引物及测序引物，其特征在于，其组成为：