[发明专利]一种重组大肠杆菌利用甘油生产乳酸的方法

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体地说将参与乳酸生物合成的一个基因克隆并与大肠杆菌高拷贝载体pUC19连接，将重组质粒转入大肠杆菌中，使用氨苄青霉素作为筛选标记，以加强该基因在大肠杆菌中的表达量，使乳酸可以在大肠杆菌中大量合成。

背景技术：

乳酸(Lactate)又名2-羟基丙酸，α-羟基丙酸或丙醇酸，广泛存在于自然界中，乳酸、乳酸盐及其衍生物是重要的生物化工产品，在啤酒酿造、医药、食品及食品保鲜、化妆品，卷烟、皮革、印染、化工等领域有着广泛的应用。乳酸纯品为无色液体，熔点18℃，沸点122℃。能与水、乙醇、甘油混溶，不溶于氯仿、二硫化碳和石油醚。分子式为C₃H₆O₃。乳酸中心有不对称碳原子，因此具有旋光性，可分为是L-型，D-型和DL-型。以L-乳酸为单体经化学合成的新型高分子材料一聚乳酸，具有优良的生物可降解性，能最终降解成二氧化碳和水，属环保型材料，可以用来解决日益严重的“白色污染”问题。由于L-乳酸是皮肤固有天然保湿因子，所以被广泛用作许多护肤品的滋润剂。很多微生物能够发酵生产D-乳酸，一些乳酸菌如保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)能够生产高纯度的D-乳酸。但是人体只能代谢L-乳酸。自然界中很多菌如一些乳酸菌：乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)和德式乳杆菌(Lactobacillus delbruckii)则能够生产L-乳酸。(钱志良，劳含章，王健。2003.)

目前国内外发酵制备乳酸所用原料多集中于农副产品，也有利用纤维等废弃物发酵乳酸的报道。但是大部分的研究还是集中于以糖质资源为原料进行乳酸的生产发酵，如以玉米淀粉或玉米粉发酵制备乳酸；以大米粉发酵制备乳酸；以红薯淀粉发酵制备乳酸。以糖质资源发酵乳酸的工艺较为复杂，发酵制备L-乳酸原料利用方式的不同决定整个工艺的进程，影响生产的成本。目前发酵制备L-乳酸对原料的利用方式主要集中于：①先经液化再糖化，进而再发酵制备乳酸的发展方向是对淀粉质原料的直接应用，经微生物利用；②糖化和发酵同时进行；③对淀粉质原料先萌发再进行发酵；④对淀粉质原料直接进行利用，不经过液化糖化处理，可简化工艺过程，但对菌种要求较高，目前产率较低。如果生产乳酸的过程中不需经过液化和糖化，这样可以大大简化工序、降低成本，为实现大规模的工业化生产奠定基础。但是，粮食资源日益紧张的今天，以糖质资源为原料发酵乳酸的过程不仅生产工艺复杂，而且粮食成本也日益增加。导致以糖为底物的发酵生产前景堪忧。此时，开发以廉价的非粮糖质为原料发酵生产乳酸具有很好的发展前景。(Ohkouchi Y.，Inoue Y.2006，Yu R.C.，Hag Y.D.1989.)。因此，我们使用了可以利用甘油的大肠杆菌作为生产菌株。大肠杆菌具有生物量较大，发酵周期短，生物背景明确，可以利用甘油这一非糖质底物等优点。由于现代工业在通过植物油和动物脂肪生产石油的过程中产生大量的废弃甘油，这些废弃甘油的比重高达10％，因此，使用大肠杆菌以甘油为底物生产乳酸可以使原料成本降低，并且可以保护环境。

发明内容：

本发明的目的是获得一种使用甘油为底物高产乳酸的大肠杆菌菌株的制备方法。本发明的另一目的是公开了高产乳酸的基因工程菌的发酵方法。

本发明以大肠杆菌BW25141(美国E.coli Genetic Resources at Yale，The Coli Genetic Stock Center)为出发菌株，将一个与合成乳酸有关的基因通过大肠杆菌高拷贝载体pUC19(美国New England BioLabs公司)转入大肠杆菌中，从而获得高产乳酸的基因工程菌LDH16172。得到的菌株可以用甘油作为碳源生产乳酸。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种使用甘油为底物高产乳酸的大肠杆菌菌株的制备方法，其步骤如下：

1)基因片段的克隆

利用引物序列1

GGGAAAGGTACCatgCGCATCCTGTTCTTCAGCACCC

引物序列2

GGGAAATCTAGAtcaGGCCCGGACCCGATTGCGTGGC

PCR扩增基因片段ldhA