[发明专利]一种KRT8基因外显子区域中SNP位点及其确定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种KRT8基因外显子区域中SNP位点的核苷酸序列，和这种核苷酸序列的确定方法，并且其应用于控制原发性胆汁性肝硬化发病。

背景技术

细胞骨架由微丝、微管和大小介于两者之前的中间丝组成。角蛋白是中间丝家族的最重要和含量最丰富的成员，分为酸性（Ⅰ型，K9-28）和碱性（Ⅱ型，K1-8，K71-80）两类。所有上皮细胞至少表达一种Ⅰ型和一种Ⅱ型的角蛋白单体，二者反向平行形成二聚体进而组成四聚体，构成角蛋白基本可溶性单位。角蛋白表达于表皮和上皮细胞且具有组织特异性，例如肝细胞和胰腺腺泡细胞主要表达K8和K18，胆管上皮细胞表达K7/K8/K18/K19，以及少量K20。除了维持细胞机械性完整外，角蛋白还参与许多细胞的重要生物学功能，包括细胞分裂、运动、囊泡的转运、抗应激及抗凋亡能力等。在小鼠和人类，角质细胞的角蛋白突变是某些皮肤和角膜疾病的直接病因，非角质细胞的角蛋白突变可增加疾病的易感性，如肝脏疾病。

CK8基因定位于12号染色体长臂十三区，亚细胞定位：细胞浆。它是构成细胞结构的主要成分之一，其突变可导致隐源性肝硬化。KRT8,KRT18常以复合物形式存在，最初是在非鳞状上皮层发现，具有保护肝脏免受机械和中毒性损伤的作用。

动物模型表明角蛋白对肝细胞有重要的保护作用。肝损伤情况下，小鼠肝脏K8和K18mRNA及蛋白的表达量可升高近3倍。K8-/-小鼠有明显的肝脏表型，C57/B1背景的K8-/-小鼠有94%胚胎期死亡伴广泛肝出血；而FVB/n背景的K8-/-小鼠虽然55%有正常的生存期，但在基础状态时表现为轻微肝炎，对Fas介导的凋亡敏感性明显增加。转基因小鼠过表达突变的KRT8基因可使小鼠肝细胞骨架断裂。与过表达野生型基因相比，这些小鼠将发展为慢性肝炎，同时易造成肝损害。

近十余年来，与肝损伤和肝衰竭相关的人类角蛋白突变位点被逐渐发现。针对KRT8SNPs研究多数位于外显子区，非翻译区的研究极少。在美国和欧洲白种人群中，K8最常见的突变位点是R341H，其次常见的突变位点是G62。R341H出现频率在美国肝病患者为6.7%，对照组为3.1%（p<0.01）;在德国患者为3.5%，而对照组中未检出（p<0.09）。在急性肝衰竭病例中，与对照组相比，K8R341H在白种人中比例相应较高（p=0.01），而美籍非洲人K8G435S更为常见（p=0.02）。这些结果均提示角蛋白突变具有人种差异性。我国对角蛋白基因变异与疾病关系进行系统分析研究的报道尚少。同时，目前没有关于定位在基因KRT8上位点rs11554491的报道。而西方国家最常见的位点rs11554495（pG61C）多态性与PBC无明显相关性。

发明内容

本发明提供一种KRT8基因外显子区域中SNP位点及其确定方法，方法简单，并应用在治疗或预防原发性胆汁性肝硬化方面的新研究。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种KRT8基因外显子区域中SNP位点，是KRT8基因第8外显子区域12563位G/T多态的SNP位点，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

本发明还提供了这种KRT8基因外显子区域中SNP位点的确定方法，是通过以下的步骤实现的：

（1）提取宿主细胞的基因组模板DNA；

（2）将所述模板DNA进行PCR扩增，其引物是：

上游：5’-ACGTTGGATGTTCTTCACAACCACGGCCCT-3’，

下游：5’-ACGTTGGATGTTCTTCACAACCACGGCCCT-3’；

将扩增后的PCR产物进行纯化；

（3）纯化后的PCR产物进行PCR延伸反应，所述延伸反应的引物是：

上游：5’-ACGTTGGATGTTCTTCACAACCACGGCCCT-3’，

下游：5’-GGAGGAGCTGGTGCGG-3’，

最后进行树脂纯化；

（4）芯片点样后，采用质谱仪检测，进行数据分析，确定SNP位点基因型。

本发明的有益效果为：本发明确定的KRT8基因外显子区域中SNP位点与原发性胆汁性肝硬化、肝硬化程度、肝移植成功率等相关。因此，通过对该基因多态的研究开发可用于原发性胆汁性肝硬化方面，如控制原发性胆汁性肝硬化发病、肝硬化病变程度或肝移植成功率。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明做进一步说明。

（一）研究对象