[发明专利]对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测引物组及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测引物组及检测试剂盒。

背景技术

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是1993年世界范围内对虾暴发性流行病的主要病原，迄今仍然没有能有效控制WSSV疫情的技术措施。国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的WSSV病原检测方法是减少白斑综合征发生和危害的重要途径。目前WSSV病原的检测方法主要有目视观察法、组织学方法、电子显微技术、生化检验法、免疫学方法和分子生物学方法等。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、费用低廉化的方向发展，但这种方法耗时、特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。自问世以来，PCR 技术凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但PCR 技术对实验环境和操作要求苛刻，产物容易污染，导致假阳性。与一般PCR 技术相比，荧光PCR 检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR 成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。建立检测WSSV快速准确的方法，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NOTOMI等建立的一种新的核酸扩增技术，在60~65 ℃的恒温条件下，历时30~60 min，即可完成核酸扩增反应。LAMP 反应中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测研究，并取得了较理想的效果。

德国QIAGEN公司研发的恒温反应及检测仪器ESE-Quant tube scanner通过吸收荧光来实时判断反应的进行。比传统LAMP终点判断产物的浊度或颜色变化更客观可靠。由于过程的数据化和自动化，可用于科研，开发新的检测方法。由于其便携、易操作，比起定量PCR仪，节约了大量成本，适合基层推广检测，符合疾病检测的快速、准确的诊断需要。

由于ESE-Quant tube scanner通过吸收荧光来判断反应是否进行，前期研究发现，常用的荧光显色剂SYBR Green I过于灵敏，在ESE-Quant tube scanner上常造成阴性反应孔出现非特异性的扩增曲线，影响结果判断。尤其在样品不纯的情况下。此反应对模板纯度要求较高，如果样品杂质含量较多，ESE-Quant tube scanner上的扩增曲线将呈现不集中，倾斜向上等。SYTO-9作为SYBR Green I的下一代产品荧光显色剂可以避免上述缺陷。

对于WSSV病毒DNA的提取可采用研磨法提取上清中的病毒核酸，而不采用蛋白酶消化组织的方法。样品为成年虾的，主要采集消化腺、前足等，虾苗则直接研磨。对于虾仁的检测，先用匀浆机对数个虾仁进行匀浆，再取少量虾肉进行研磨提取。这样节省了蛋白酶作用的时间，更重要的是消除了大量杂质及色素，减少了对后续LAMP反应的抑制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供对虾白斑综合症病毒的LAMP检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

WSSV-F3：ACAACACTGTGACCAAGAC（SEQ ID NO:1）；

WSSV-B3：GTTCCACACCTTGAATGTTC（SEQ ID NO:2）；

WSSV-FIP：CCCAAGGTGTCGCTGTCAACTGTGACTGCTGAGGTTG（SEQ ID NO:3）；

WSSV-BIP：CCGCAATGGAAAGTCTGATGCCACGGGAGTGATGACAAG（SEQ ID NO:4）；

WSSV-LF：CAGTCATCTTGAAGTAGCCTGA（SEQ ID NO:5）；