[发明专利]去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及纳米脂质体生物转化的优化方法，具体涉及一种基于去氧孕烯中间体纳米脂质体的生物转化方法。

背景技术

现有技术公开了微生物转化反应通常在常温常压下进行，相比于化学反应具有专一性强、污染少和产率高的优点，因此制药工业通常利用两者的优势配合使用，微生物转化可以为药物的化学合成提供关键中间体。尽管微生物转化具有独特的优势，但工业应用中常受到实际困难的制约，其中，底物对菌体的毒性和对反应的抑制作用是困扰疏水性化合物微生物转化的关键问题。实践显示，由于疏水性底物在水中溶解度极低，因此增加培养基中底物量并不能够提高转化率，随投料浓度的提高，转化率显下降趋势，这可能是过多的底物沉积于细胞表面而限制了反应物和产物的扩散，因此提高转化率的关键在于提高甾体底物的有效反应浓度，可以从提高底物溶解度和改善细胞通透性两个方面解决这一问题。

本发明的发明人已经进行研究关于将纳米脂质体应用于生物转化的技术，即采用卵磷脂为载体将疏水性底物制备成底物纳米脂质体，再进行微生物转化。这样既能够利用卵磷脂增加细胞膜通透性的特性，又能发挥纳米脂质体生物相容性好、提高水溶性及巨大比表面积的优势，促进底物向细胞内运输，提高生物利用度，使其进入微生物细胞内的量增加，从而提高转化体系底物投料浓度和转化率。

左旋乙基甾烯二酮的11α羟基衍生物是制备强效孕激素去氧孕烯的关键中间体。去氧孕烯是口服避孕药妈富隆的主要成分，由于妈富隆的副作用小，效果可靠，应用已越来越广泛，市场需求量也随之增加。美国专利（US2005/0234251A1）公开的去氧孕烯合成工艺采用左旋乙基甾烯二酮为起始原料，首先利用Aspergillus ochraceous经生物转化引入11α羟基再进行一系列化学反应合成去氧孕烯。该专利以有机溶剂DMF溶解底物左旋乙基甾烯二酮投料，投料浓度2g/L-6g/L时，羟化反应转化率为35%-60%。

本发明拟提供一种纳米脂质体应用于生物转化中提高生物转化产率的优化方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于设计将纳米脂质体应用于生物转化中提高生物转化产率的优化方法，特别是提供去氧孕烯关键中间体11α羟化的纳米脂质体生物转化优化生产方法。

本发明经过大量实验证明，纳米脂质体应用于生物转化中纳米脂质体制备方法和储存方式、培养条件、投料浓度对转化产率具有较大的影响。本发明通过优化纳米脂质体制备方法和储存方式、培养基pH、底物投料浓度、转化时间和菌龄，建立了左旋乙基甾烯二酮11α羟化的纳米脂质体生物转化的优化条件，底物投料浓度和转化效率与游离底物投料方式相比都有明显提高。

本发明公开的优化生产左旋乙基甾烯二酮11α羟化衍生物的纳米脂质体生物转化参数为：采用薄膜分散法结合高压均质机制备底物纳米脂质体并制成冻干粉储存、培养基pH为6.5，转化时间60-70h，菌龄24h，投料浓度2g/L-7g/L，微生物菌种采用金龟子绿僵菌突变株（Metarhizium anisopliae）11490（CCTCC M2011240）。在此优化条件下，左旋乙基甾烯二酮11α羟化衍生物转化率高达60%-80%。

更具体的，本发明的去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法，其特征在于，其包括步骤：

1、底物纳米脂质体的制备及保存

采用薄膜分散法将左旋乙基甾烯二酮以卵磷脂为载体经高压均质机制成纳米脂质体；添加保护剂后真空冷冻干燥、-20℃储存备用。

2、微生物与培养

微生物菌种：Metarhizium anisopliae11490，菌种保藏号CCTCC M2011240。该菌种能在左旋乙基甾烯二酮上引入11α羟基；

斜面培养：将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，其中添加质量百分比为0.25%的蚕蛹粉，26～30℃培养5～10天；

发酵培养：将上述斜面菌种在无菌条件下用接种环接1环于装有40mL液体培养基（10g/L葡萄糖、10g/L黄豆粉、5g/L蚕蛹粉，pH6.5）的250mL摇瓶中，28℃条件下，旋转式摇床220r/min培养24小时，得种子液；

3、生物转化

将制得的底物纳米脂质体冻干粉投入上述制备好的种子液中，相同条件下转化48-60h，取转化液分析；

4、分析方法

HPLC

流动相：A水，B乙腈

波长：215nm/254nm

流速：1.2mL/min

梯度洗脱：