[发明专利]一种无动物源的低蛋白培养基

说明书

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种适于CHO细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无动物源的低蛋白培养基。

背景技术

以中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary，CHO)细胞为代表的真核表达系统是现代制药工业的重要组成部分，与其他表达系统相比，它具有许多优点:第一，具有高效的重组基因扩增和表达能力；第二，有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；第三，很少分泌自身的内源蛋白，具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；第四，CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长，也可以悬浮生长。即CHO细胞既可以贴壁生长在微载体介质表面，也可以悬浮生长在发酵罐中。微载体作为一种新兴的利用CHO细胞贴壁附着在微载体上进行细胞培养的技术，广泛地应用于组织工程中种子细胞的扩增（王常勇.采用微载体技术大规模培养组织工程种子细胞[J].生物医学工程与临床，2002，6(1)：51254.）；发酵罐或生物反应器等大规模悬浮培养CHO细胞的技术，以其易于扩大化等优势，也在工程细胞培养中得到了广泛应用。（陈志南，杨向民.基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术[J].中国医药生物技术，2009，4（5）：325－328.）两种培养方式均在重组药物的研究中占据重要的位置。从这个角度来讲，研发一种既满足CHO细胞不同生长方式，同时又适合其大规模高密度扩增的培养基具有重要的应用价值。

此外，传统的CHO细胞贴壁培养是在含8%～10%牛血清的培养基中扩增培养，血清虽然营养成分丰富，但是有很多不足的地方：第一，血清各批次间差异很大，其成分不能保持一致；第二，血清或血清来源的物质，如血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素或其他外源性物质中可能存在支原体或病毒等污染物，会对细胞产生毒害作用；第三，血清组分复杂，给产品纯化带来了巨大困扰，不利于产品质量的提升；第四，由于组分不明确，很难根据不同细胞株设计和优化能够支持其高密度培养和高水平表达的培养基。

综上可知，在CHO无血清培养基中摒弃动物来源成分，同时尽可能降低培养基中的蛋白质含量，无论从产品产量还是质量角度来讲都是开发CHO无血清培养基的主流方向。

关于无血清培养基的开发，已经有过许多尝试：

Gyun Min Lee等人（Gyun M L，Eun J K，No S K，et al.Development of a serum-free medium for the production of erythropoietin by suspension culture of recombinant Chinese hamster ovary cells using a statistical design[J].Journal of Biotechnology，1999（69）：85-93.）开发了无血清培养基，以IMDM培养基为基础培养基，添加了2mg/LFe(NO₃)₃·9H₂O、0.0025mg/L CuCl₂、和1mg/LZnSO₄·7H₂O作为微量元素，同时添加了2.5-5mg/L胰岛素，10-20mg/L转铁蛋白等营养物质，用于表达EPO的CHO工程细胞的悬浮培养。

Chi Hsien Liu等人（Chi H L，I-Ming C，Shiaw M H，et al.Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells[J].Enzyme and Microbial Technology，2001，28：314-321.）开发了无血清培养基，以IMDM培养基为基础培养基，添加了1%SITE（硒，胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺），0.3g/L酵母抽提物，0.09%亚麻油脂-牛血清白蛋白，用于CHO细胞的无血清悬浮培养，这些添加物能够很好的促进CHO细胞生长。