[发明专利]污水处理厂亚硝酸盐氧化菌荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中亚硝酸盐氧化菌的定量检测。

背景技术

污水生物脱氮技术由于经济、高效的特点而广泛应用于污水处理领域。传统污水生物脱氮的原理是指氨氮被氨氧化菌氧化成亚硝态氮（亚硝化阶段），再由亚硝酸盐氧化菌氧化成硝态氮（硝化过程）；之后硝态氮和亚硝态氮被反硝化成氮气（反硝化过程），从而实现污水中氮的去除。对于传统生物脱氮技术而言，亚硝酸盐氧化菌作为硝化过程的主要功能微生物之一，在污水生物处理系统内的生物活性和菌群分布的稳定性，是保证污水生物脱氮系统稳定运行的关键因素。污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，有的污水处理系统中只含有其中的一个属，而有的污水处理系统中含有两个属。为了全面了解系统中的亚硝酸盐氧化菌的分布情况，需要分别定量检测这两个属的微生物数量，二者数量之和是亚硝酸盐氧化菌的总量。近年来，在传统生物脱氮理论的基础上产生了短程脱氮新理论，即将硝化过程控制在亚硝态氮，然后直接进入反硝化，从而使生化反应大大缩短，被称之为短程硝化反硝化。相比于传统方法，短程脱氮理论上减少25%硝化需氧量、40%反硝化碳源，更具实用价值。实现短程脱氮的关键是将硝化产物控制为亚硝酸盐，即去除亚硝酸盐氧化为硝酸盐的过程。从微生物学的观点来看，就是抑制或淘汰亚硝酸盐氧化菌。对于短程脱氮技术而言，准确监测并定量亚硝酸盐氧化菌的动态变化是实现短程脱氮并保证其稳定运行的关键。分子生物技术的快速发展为污水生物处理系统内微生物研究提供了新的分析方法和手段。因此，采用分子生物技术对不同工艺、水质条件下的亚硝酸盐氧化菌菌群结构、活性等进行研究分析，能够为污水生物脱氮系统的长期稳定运行提供有力保障。

实时荧光定量PCR技术作为一种核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点，逐渐应用于污水生物处理系统中特定菌群的定量分析。已有的实时定量PCR技术应用于污水短程生物脱氮的研究，主要是对氨氧化菌的定量。但实现短程脱氮的关键在于亚硝酸盐氧化菌是否被抑制或淘汰。对于亚硝酸盐氧化菌，往往通过亚硝酸盐积累率达到较高的水平（>80%）逆推出亚硝酸盐氧化菌被成功淘洗的结论。这种逆推显然不够严谨，因为它无法揭示亚硝酸盐氧化菌是活性受到抑制还是已被彻底淘洗出系统，这两种情况将会产生两种不同的运行效果。如果是亚硝酸盐氧化菌的活性受到抑制，当环境条件的变化有利于生长时亚硝酸盐氧化菌将恢复活性，导致短程脱氮运行不稳定甚至完全破坏。如果是亚硝酸盐氧化菌已被彻底淘洗出系统，则更加有助于短程脱氮的稳定运行，短期的环境条件的变化不会对短程脱氮产生影响。由于缺少对污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌的检测，对于不同运行条件下系统中亚硝酸盐氧化菌的群落结构及其动态变化不清楚，进而无法准确阐述短程脱氮的形成机制。

本发明采用实时荧光定量PCR技术对污水处理厂中的亚硝酸盐氧化菌进行定量检测。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下三方面：

（1）标准品DNA的来源。现有技术主要是从纯培养或人工配水富集的目标菌中提取基因组DNA，或是化学合成DNA片段作为标准品。目标菌的纯培养需要较长的时间、费用较高。更难以解决的是亚硝酸盐氧化菌中的硝化螺菌属目前还无法实现纯培养。人工配水富集的目标菌的菌群单一，无法获得实际污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌的所有优势属的标准品。化学合成DNA片段作为标准品首先要通过基因测序知道目标基因序列，否则无法合成。而本发明采用的标准品全部来源于处理实际生活污水的反应器，无需目标菌的纯培养、人工配水富集目标菌和目标基因序列。

（2）定量检测的环境样品及目标微生物。①目前，实时荧光定量PCR主要应用于生命科学、医学等领域对病毒、致病菌的检测分析。而本发明的待测样品为污水处理系统中的活性污泥，样品本身具有极强的特殊性。由于活性污泥受废水污染，其中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂质等，还有其它与亚硝酸盐氧化菌共存于活性污泥中的菌胶团，对DNA的提取纯化干扰较大，并进而影响后续的PCR扩增。因此，活性污泥微生物基因组DNA的提取方法、PCR扩增体系及反应条件需要特殊确定，难度较大。②本发明定量检测的目标微生物是亚硝酸盐氧化菌，已有研究证实污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括两个属，即硝化菌属和硝化螺菌属。由于本发明的标准品来自于实际污水处理系统，运行条件和废水成分的复杂性使得亚硝酸盐氧化菌菌群丰富，获得两个主要属的标准品，因此能够对污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌进行全面的定量分析。