[发明专利]喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法

权利要求书

1.一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡，其特征在于包括塑料卡壳和封装于塑料卡壳内的试纸条，所述的塑料卡壳是由底座和面盖嵌合在一起构成的，底座上设有放置试纸条的槽和与面盖相嵌合的卡口，面盖上设有观察窗和加样孔以及与底座相嵌合的卡齿，在观察窗旁边分别印有代表检测线的T和代表质控线的C，其中代表检测线的T靠近加样孔的一侧；所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有交叠连接的样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫，其中检测垫的位置与塑料卡壳上观察窗的位置相对应，样品垫的位置与塑料卡壳上加样孔的位置相对应，所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基础，包含3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液喷涂的检测线和羊抗鼠IgG溶液喷涂的质控线，所述金标垫上灌注有胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡，其特征在于：所述的样品垫、金标垫和吸水垫上方覆盖有胶膜保护层。

3.一种权利要求1所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品垫的制备：将玻璃纤维棉用含有质量浓度为2%的BSA、质量浓度为1%的蔗糖、质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的NaN₃的PBS缓冲液处理后，干燥备用，即为样品垫；

（2）金标垫的制备：将玻璃纤维棉裁成4 mm宽的细条，放入含有质量浓度为5%的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05%的NaN₃的PBS缓冲液中20 min，37 ℃恒温烘干，然后将胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体灌注已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4 h，即为金标抗体结合垫；

（3）检测垫的制备：将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液放于A池，羊抗鼠IgG溶液放于B池，展平压紧，开机后将检测抗原和二抗分别点射喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，室温自然干燥后，将其浸入BSA质量浓度为1%的PBS缓冲液，pH值为7.4的封闭液中30 min，37 ℃烘干后，加入干燥剂，4 ℃密封保存；

（4）吸水垫的制备：将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4mm宽的细条，并用胶膜进行一侧封闭，干燥备用，即为吸水垫；

（5）喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备：首先将制备的样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫依次附着于支撑层上，由左到右交叠连接，叠压宽度2 mm，然后用切割机制成宽4 mm，长60 mm的试纸条，封装于带有加样孔和观察窗的塑料卡壳内，即制得喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡。

4.根据权利要求3所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于：所述的检测线上喷涂的检测抗原是3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液，其制备方法为：在N,N-二环已基碳二亚胺活化和催化下，喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺发生酯化反应，反应产物再与鸡卵清白蛋白偶联，即制得检测抗原。

5.根据权利要求3所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于：所述的金标垫上标记的抗体是抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体，其制备方法为：（1）人工抗原合成：采用活泼酯法将喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸和载体蛋白偶联，制得免疫原和包被原；（2）动物免疫：以雌性Balb/C小鼠作为免疫动物，背皮下多点注射法免疫5-6次；（3）细胞融合：在聚乙二醇1500的作用下，将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS0细胞进行融合；（4）杂交瘤细胞株筛选：用间接ELISA和间接竞争ELISA筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株；（5）细胞亚克隆：采用有限稀释法将阳性孔细胞株进行亚克隆，制得纯化的单克隆源杂交瘤细胞；（6）单抗制备：体内诱生腹水法制备抗喹乙醇代谢物单克隆抗体，饱和硫酸胺法纯化抗体后，进行胶体金标记。