[发明专利]黄曲霉特异性单链抗体的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于食品有害微生物分子检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉特异单链抗体和单克隆抗体的制备方法及其在黄曲霉免疫学检测中的应用。 

背景技术

黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)是广泛分布的产生黄曲霉毒素的丝状真菌，可以侵染花生(Arachis hypogaeaL.)、玉米(Zea maysL.)、棉花(Gossypium spp.)等引起多种作物的病害，危害粮食和经济作物的生产，造成严重的经济损失。在粮食储藏以及食品和饲料的加工、运输等环节也及易发生黄曲霉和寄生曲霉的污染，导致黄曲霉毒素的积累，从而严重威胁人畜健康及食品安全。黄曲霉毒素主要有AFB_l，AFB₂，AFG_l，AFG₂四种类型，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，在我国华南、华中、华北地区产毒菌株分布较广。黄曲霉毒素是真菌生长过程中的次级代谢产物，具有强烈的急性毒性和强烈的致癌、致畸作应，被国际癌症研究机构(IARC)认定为I类致癌物。此外，黄曲霉菌是仅次于烟曲霉(A.fumigatus)的可引起人畜侵袭性曲霉病的第二大类病原菌，严重危害人畜健康。黄曲霉毒素非常稳定，高温(200℃)处理、紫外照射都不能使其分解，一旦发生污染很难进行除去。因此，快速有效的对黄曲霉、寄生曲霉检测方法对于监测农作物病害发生、从源头上控制黄曲霉毒素的污染具有重要意义。本发明选用的抗原制备菌株是高产毒的黄曲霉菌株。 

目前对黄曲霉、寄生曲霉的监测方法主要是传统生物学方法(如：传统培养基法)、分子检测(如：PCR)、免疫学检测(如：ELISA)。传统培养基法耗时太长，PCR分子检测方法需要特殊的仪器和器材，需专门提取样品的DNA，样品前处理步骤繁琐，操作人员需要具备专门技能。此外，这些传统检测方法的现场实时监测及检测方法的微型化都受到限制。酶联免疫吸附法(ELISA)检测具有较高的特异性和灵敏度，样品不需要复杂的前处理，便于微型化操作和进行现场实时监测，不受仪器设备和专业操作人员的限制。ELISA检测中常用的酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)标记的抗体，一般通过化学交联的方法将催化酶标记到抗体上。具有随机反应特点的化学交联过程所产生的交联位点可能会影响抗体与抗原的结合，导致抗体特异性和亲和力下降，对交联反应的优化和酶标抗体的质量检测也会导致生产成本的提高。利用生物技术得到的单链抗体(scFv)具有单克隆抗体的同质性的特点并且基因编码序列明确，同时可以通过微生物发酵进行大量生产。此外，还可以通过基因工程手段对单链抗体进行改造，可以得到抗体和酶的融合蛋白，这种同时具有抗原识别能力和酶催化活性的双功能蛋白可以极大促进ELISA检测方法的应用。本发明通过免疫鸡，在克隆鸡的抗体基因基础上构建了单链抗体噬菌体展示文库，利用噬菌体展示方法对文库进行了筛选之后得到了可以识别黄曲霉和寄生曲霉的单链抗体基因。通过免疫小鼠制备了一株可分泌黄曲霉特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过对单链抗体基因进行基因工程改造得到了scFv-AP融合蛋白并在大肠杆菌中进行大量表达。该scFv-AP融合蛋白可以与黄曲霉特异单克隆抗体配套使用在双抗体夹心ELISA检测当中。该检测方法灵敏度高，不需要额外的酶标二抗操作简便迅速，可以应用于农作物种植、粮食储藏、食品和饲料加工等领域中的对黄曲霉和寄生曲霉污染的检测。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其目的之一在于提供一种黄曲霉特异单链抗体基因，该基因利用噬菌体展示技术从免疫后的鸡源单链抗体文库中获得，申请人将该基因命名为AfSA4，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示(长度为756bp)，其编码的蛋白质的氨基酸的序列如序列表SEQ IDNO：2所示。本发明的黄曲霉特异单链抗体基因由轻链可变区和重链可变区组成，轻链可变区V_L由312个核苷酸编码，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示(长度为390bp)；重链可变区V_II由390个核苷酸编码，其核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示(长度为312bp)。 

本发明的目的之二在于提供了一种黄曲霉特异单链抗体蛋白，其蛋白质的序列如SEQ IDNO：2所示，其轻链可变区V_L由104个氨基酸编码，序列如SEQ ID NO：4所示；重链可变区V_II由130个氨基酸编码，其序列如SEQ ID NO：6所示，轻链可变区和重链可变区由连接肽(GGSSRSSSSGGGGSGGGG)连接。