[发明专利]猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪瘟病毒抗体的免疫学检测，具体涉及一种猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法。

背景技术

猪瘟病毒（CSFV）属于黄病毒属的成员。由于CSFV的高致病力和高致死率，它已给养殖业造成了巨大的损失。猪感染高致病力毒株后在潜伏期即可造成感染，经历急性猪瘟或亚急性猪瘟临床症状的猪在出现症状前大量排毒，而耐过后的猪只体内有明显的CSFV抗体，且不再排毒。感染温和性毒株的猪呈慢性感染，在病死前会长期或间歇性地排毒。怀孕母猪可以通过胎盘感染胎儿导致流产、木乃伊化或产出弱猪、畸形胎等。先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。猪也有可能感染BVDV或BDV。尽管这些感染通常呈温和过程并且是自限性的，但有效的将它们同猪瘟病毒区分是很重要的。我国自首次分离到该病毒以来，已先后在广东、上海、福建等多省暴发和流行，目前该病在我国已普遍存在。现有的检测方法主要有病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶技术，免疫胶体金技术，免疫荧光抗体染色技术，ELISA、PCR和real time PCR等，各有优缺，且特异性差异较大。同时，方法对样品和人员的要求较高。由于猪感染猪瘟病毒或免疫猪瘟疫苗均能产生相应的抗体，且抗体能较好的反应其免疫或感染病毒的情况，因此，可以通过检测CSFV的抗体来反应其免疫感染病毒情况。

AlphaLISA技术主要依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用。当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接近时, 激光激发级联反应，从而产生极大放大的信号。具体来说，在680nm 的激光照射下, 供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到铕，发射波长为615nm。在生物分子不存在特异的互相作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。AlphaLISA技术凭借一种专有的基于微珠的技术，将传统的ELISA 转化为均相的“无需洗涤”的检测。

AlphaLISA技术所使用的稀土元素铕（Eu），发射波长非常尖锐，为615nm，从而大大减少了检测样品中杂质的干扰，可直接检测复杂样品（血清和体液）中的生物分子。在临床上，这非常适合测定人和动物的血清和体液样本。而此技术的高通量、高灵敏度、操作简便，能更准确、更省时的测定细胞因子等生物标志物。目前，已广泛用于药物筛选、细胞因子、病变基因、血清抗体等的检测。

中国发明专利申请（申请号为：201210031802.X，201210047016.9）分别公开了采用AlphaLISA技术检测肠道病毒71型衣壳蛋白（Anti-EV71 VP1 IgM）和甲型肝炎病 IgM 的方法。但是，目前尚无利用AlphaLISA技术检测猪瘟病毒抗体的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，以及编码试剂盒中抗原的基因及其扩增该基因所用的引物。第二目的是提供一种用于食品安全检测的猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测方法。

为实现第一目的本发明采用的技术方案是猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，包括供体微珠、受体微珠、猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体和带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原。

其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PE,AS101D (即Nickel chelate Donor beads(PE,AS101D))，浓度为80μg/mL，500μL；所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE,AL105C（即Anti-mouse IgG Acceptor beads(PE,AL105C)） ，浓度为80μg/mL，500μL；所述带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有与猪瘟病毒E2蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。

前述的试剂盒，包括供体微珠80μg/mL、受体微珠80μg/mL、猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体100nM/L及带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原180nM/L；使用时，以总体积20μL计，每孔添加量为：受体微珠4μL、供体微珠5μL、180nM/L带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原 5μL、100nM/L 猪瘟病毒抗E2蛋白单克隆抗体5μL及待测样品1μL。