[发明专利]一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法

说明书

技术领域

本发明属于利用动物肌纤维活性改良肌肉功能及肌肉品质性状的技术领域，具体是一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法。

背景技术

肌纤维是构成肌肉的基本单位，肌纤维的形成是极其复杂的，经历了一个由前体干细胞发育为成熟肌纤维的渐进过程，大体上可以被分为四个阶段：第一阶段是来自中胚层的间充质干细胞发生终末分化形成单核成肌细胞；第二阶段是单核的成肌细胞融合形成梭形的多核细胞肌管；第三阶段是肌管进一步分化形成成肌纤维；第四阶段是肌纤维的生长并最终达到成熟。大多数陆栖脊椎动物肌纤维发育的前三个阶段在胚胎期基本上就已经完成，动物出生后肌纤维的数目不再改变，肌肉的生长主要依赖于肌纤维长度增加和直径增大。因此，胚胎期动物肌纤维的发育将影响其出生后肌肉的产量。而肌纤维类型并不是出生前就确定下来的，在动物生长过程中，它受到品种、年龄、营养、内分泌及机体各级调控因子的影响。根据肌纤维的形态、功能和生理生化特性，可将肌纤维分成不同的类型，在禽类较常用的肌纤维分类方式是根据所含的酶系及其活性特点，将肌纤维分为三型：慢肌纤维（红肌纤维、I型、氧化型肌纤维）；快红肌纤维（中间型纤维、IIa型、快速氧化型纤维）；快白肌纤维（白肌纤维、IIb型、快速酵解型纤维）。将肌纤维的类型区分开，可以看出不同类型肌纤维的活性和功能，据报道，胚胎期到新生期也被称为是次级纤维形成期，是肌纤维类型分化非常重要的时期，胚胎期动物肌纤维的发育将影响出生后的肌肉产量，胚胎期肌纤维特性是决定肉质和代谢的重要因素，因此，在胚胎期进行肌纤维类型的准确判定、及对各种类型肌纤维特性的研究对研究骨骼肌功能及肉品质性状的遗传改良将具有重要的意义。

目前现有的方法主要是采用对肌纤维Guth-Samaha肌球蛋白染色方法进行骨骼肌肌纤维分型，该方法自上世纪70年代建立以来，已成为骨骼肌功能相关研究的重要手段之一。该染色方法的原理是，三磷酸腺苷酶（ATP酶）与肌肉的能量代谢密切相关，可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应放出大量能量，用于运送离子进出细胞，同时供给生物体进行需能生命过程。利用染色剂将骨骼肌纤维染色后，磷酸与钙离子结合，在酶活性处形成无色的磷酸钙，磷酸钙经氯化钴处理形成磷酸钴，再经硫化铵处理形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。因此通过这种染色方法，可以根据不同肌纤维的ATP酶的酶活性的高低，形成不同量的棕黑色颗粒沉积于肌纤维中。然后，可根据反应的深浅程度区分不同肌纤维类型。

现在比较先进的Guth-Samaha肌球蛋白染色方法，是刊登在《解剖学杂志》中的文章“肌球蛋白三磷酸腺苷酶的染色技术”所公开的方法（肌球蛋白三磷酸腺苷酶的染色技术.解剖学杂志，2004，27：104-105，作者高美钦等）

染色方法主要包括以下步骤：

（1） 将肌纤维切片置于固定液中固定5分钟；

（2） 碱性预孵液（巴比妥纳贮备液：巴比妥纳206mg，氯化钙100mg，双蒸水50ml，4g/L NaOH调pH值至10.4±0.01）中25℃预孵10分钟；

（3） 置底物孵育液（巴比妥纳贮备液10ml，ATP-二钠盐15mg，4g/L NaOH调pH值至9.4±0.01）中37℃孵育60分钟；

（4） 入2%氯化钴溶液中室温反应3分钟；

（5） 充分水洗，双蒸水洗过一遍；

（6） 入1%硫化胺溶液反应1分钟；

（7） 流水冲洗5分钟；

（8） 脱水、透明、中性树胶封片。

上述方法适用于人、鼠等哺乳类动物，但存在所用的试剂配制比较繁复，并每次都要新鲜配制的问题，限制了该方法的推广应用。同时，由于不同物种骨骼肌肌球蛋白ATP酶的PH值稳定性存在差异，利用此染色剂，对鸭骨骼肌中肌纤维不适用，纤维界限不清楚，染色背景深，无法区分出肌纤维的类型，目前尚未有鸭骨骼肌纤维类型鉴别方法的报道，鸭骨骼肌纤维类型的鉴别技术尚未建立。

因此，需要开发一种简单方便，能够快速准确鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法。

发明内容

为解决利用现有相近领域鉴别不出鸭骨骼肌中肌纤维类型，以及现有鸭骨骼肌肌纤维类型鉴别方法空白的缺陷，本发明提供了一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，实现了利用此方法能够清晰的鉴别出骨骼肌中各种肌纤维类型的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明开发出的一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；