[发明专利]一种利用硫酯酶合成Cilengitide的方法

说明书

技术领域

本发明属于绿色化工和酶催化技术领域，具体涉及一种利用硫酯酶（TE）介导的化学酶法催化合成抗肿瘤化合物Cilengitide的方法。

背景技术

Cilengitide是含有RGD（arginine–glycine–aspartate）的五环肽。作为整合素抑制因子，也是癌症个体化治疗研究的一个新类别抗新血管生成的孤儿药物，这类药物可以竞争、干扰肿瘤细胞与细胞外基质蛋白（extracellular matrix protein，ECM）的相互作用，阻止内源性配体与之结合，从而抑制肿瘤血管的生成和细胞的增殖、侵袭和转移作用。目前抗肿瘤化合物Cilengitide已经完成了包括胶质瘤（glioblastoma,GBM）在内的多种肿瘤的II-III期临床试验。GBM是最具侵略性的恶性肿瘤，而“Cilengitide”是目前唯一处于III期临床并用于治疗该癌症的整合素拮抗剂。近期结合III期临床的数据，EMA（European Medicines Agency）对Cilengitide做出很高评价，预期不久Cilengitide将通过III期临床评估，作为治疗GBM的特效药走向市场。但与乐观的前期临床研究不同，目前以传统的环肽化学全合成获得的Cilengitide价格十分昂贵（约为35000元/g），这将使得其在未来市场化的推广中障碍重重，进而难以惠及普通大众。同时化学全合成法也存在高污染、高消耗、多副反应和产率低等不足。因此，如何改变Cilengitide现有环肽合成方式，寻找新的合成途径，在提高合成效率的同时又降低合成成本是值得深入研究的一个问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种Cilengitide的新型的合成方法，即利用利用硫酯酶（TE）介导的化学酶法催化合成抗肿瘤化合物Cilengitide，在提高了合成效率的同时又降低合成成本。

本发明首先提供硫酯酶的一种新用途，是在合成Cilengitide中的应用；

本发明还提供一种合成Cilengitide的方法，是用硫酯酶来催化底物合成Cilengitide。

上述的底物多肽的序列为：asp-phe-met-val-L-arg-gly；

更具体的，底物为L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly；

为了使底物能更好的和TE酶结合，在C端加上了一个BMT（苄硫醇），

上述的硫酯酶，包含有：

1）氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2）与1）中的酶具有同源性，且能用来催化用于合成Cilengitide的底物来合成Cilengitide的酶。

上述2）中的同源性，为具有90%以上同源性；优选为95%以上同源性，最佳为98%或以上的同源性。

上述的硫酯酶，还包括有其它来源的，与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶同源性低于60%，也具有催化底物合成Cilengitide的酶，上述的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5-12。

为了增加催化合成的效率，对氨基酸序列为SEQ ID NO:1的硫酯酶进行了突变的改造，改造后的硫酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明的合成方法与传统的化学合成法相比，在催化时间上缩短了48倍，由原先的的32h（化学法）缩短为40min。在得率上由先前的27.2%，提高到了79.3%。因此，该方法使用可以大幅度的提高Cilengtide的合成效率，降低合成成本。

附图说明

图1：本发明硫酯酶催化合成的Cilengtide的HPLC分析图谱;图中各个峰分别为：Cilengitide线性底物(Su,30min)，水解产物(Hy,17min),环化产物（Cy,19min）。图中，A，B，C为标准品的HLPC图谱；D为没有TE酶加入的催化反应阴性对照图谱；E为TE酶加入的催化反应的图谱;

图2：Cilengitide标准品的二级图谱;

图3：用于TE催化的Cilengitide线性底物的二级图谱;

图4：TE酶催化后产物中环肽的二级图谱；

图5：TE酶催化后产物中线性底物的二级图谱。

具体实施方式

对于本发明所涉及的术语的解释如下：