[发明专利]基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法及其在目的基因（核酸）检测中的应用。

背景技术

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

TaqMan荧光探针PCR技术是实时荧光定量PCR技术的一种，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一条特异性的TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团包括FAM、TET、VIC、HEX等。

2000年Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)，中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1LAMP试剂盒的研制。通过近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：

(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。

(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在lh内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30min均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至10⁹倍，达0.5mg/mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。

(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，因此其特异性极高。

(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。

LAMP技术目前的检测方法主要为以下几种：一是普通电泳法，将LAMP扩增产物进行普通凝胶电泳，但此检测方法无特异性，因为只要发生了LAMP反应，电泳条带均一样。二是荧光染色法，染料主要包括：SYBR Green I、羟基萘酚蓝（Hydroxynaphthol blue，HNB）、钙黄绿素。但是，SYBR Green I染料只要扩增出核酸便显示阳性，无特异性；羟基萘酚蓝与钙黄绿素均是指示LAMP的副产物镁离子的变化，也无特异性。三是浊度法，此法主要是检测LAMP的副产物焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，只要发生LAMP反应溶液即变浑浊，此法也无特异性。

综合以上三种检测方法，均不能对扩增产物进行特异检测，均为间接检测，这也就带来了一个非常大的问题，如果LAMP发生了非特异性扩增，那么用这些检测方法获得的结果均是假阳性，因此，需要对LAMP技术进行改进，从根本上解决检测结果假阳性的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物和Taqman探针。