[发明专利]一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种谷氨酸脱羧酶重组菌，其特征在于，它是导入了L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的大肠杆菌；其中所述的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因来源于酵母Kodamaea ohmeri NH-9，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）以酵母Kodamaea ohmeri NH-9的基因组DNA作为模板，以包含BamH I和Xho I酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增：

引物1：5′-CGGGATCCATGTTACACAGGCAC-3′；

引物2：5′-GCCGCTCGAGTCAACATGTTCCTCT-3′；

PCR的扩增体系为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各2μL，dNTP4μL，10×Taq缓冲液5μL，Taq酶1μL，ddH₂O34μL；

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后50℃退火1min，72℃延伸1min，循环25次；最后72℃延伸10min；

回收PCR扩增产物，经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-gad；

（2）将重组质粒pET-gad转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布含25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养12～16h得到单克隆；

（3）挑取10个单克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h后提质粒，用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切，根据电泳结果判断含有与gad基因相同大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-gad，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为目的基因工程菌。

3.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组菌在制备γ-氨基丁酸中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将谷氨酸脱羧酶重组菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以1～10(v/v)%的接种量转接入发酵培养基中30～40℃发酵培养2～3h，再加入终浓度0.5～1.0mM的IPTG或终浓度2～5g/L的乳糖诱导，并置于20～25℃下诱导表达20～24h；将诱导表达后的发酵液离心，获取湿菌泥，用pH3.8～4.6的醋酸缓冲液洗涤并悬浮细菌，将L-谷氨酸加入到细胞悬浮液中，加入盐酸吡哆醛15-25mg/L，反应开始，维持反应温度35～40℃，反应6～12h；反应过程中观测有无气泡产生，待无气泡产生时，停止反应，离心除去菌体，母液加入5g/L活性炭在80～100℃加热15～30min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到γ-GABA粗品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将L-谷氨酸加入到细胞悬浮液中，加入盐酸吡哆醛15-25mg/L，反应开始，维持反应温度35～40℃，反应6～12h；反应过程中观测有无气泡产生，待无气泡产生时，继续添加底物，继续反应，连续批次添加底物后，待反应无气泡释放时，离心收集菌体，母液用加入5g/L活性炭在80～100℃加热15～30min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到γ-GABA粗品。