[发明专利]一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及涉及水稻原生质体的分离的新方法以及质粒转化原生质体的相关应用，主要是一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法。

背景技术

原生质体瞬时表达是细胞功能学研究的重要操作手段。近年来，双子叶植物拟南芥原的生质体被广泛用于胞内运输机制的探索、蛋白的亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA与蛋白质的相互反应等许多领域。单子叶植物水稻的原生质体的相关报道也越来越多。但由于研究起步较晚，在原生质体分离和转化的方法上还有很多可以改进的地方。在过去很长一段时间内，单子叶植物原生质体是借助植物组织培养技术建立的悬浮细胞培养体系分离而来的，这种方法所需周期较长，且培养过程中容易染菌，并不能做到瞬时、快捷。研究发现，以水稻幼茎，叶和叶鞘等组织为试验材料，也可以分离出优质的原生质体。但幼茎、叶及叶鞘的原生质体形态上还有一定的差别，这些差别并没有完全证实。此外，不管是在拟南芥、水稻还是其他植物的原生质体分离过程中，在获取原生质体的过程中都采用离心的方法收集，容易混有大量的细胞碎片，会干扰后续过程中的转化效率及其他酶促反应。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，它能够克服采用离心法分离原生质体造成细胞碎片等杂质含量高的缺陷；明确茎、叶原生质体的形态差异；得到高纯度的原生质体；增进转化效率。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，主要是根据密度梯度自沉降的方法可以不使用离心而使大小均一的细胞在合适的浓度梯度上沉淀，以及原生质体自身可以摄取外源大分子物质的原理，酶解水稻幼茎细胞壁获得的原生质体和建立高效的瞬时表达体系，该方法包括如下步骤：

（1）水稻种子去颖壳，消毒；

（2）消毒种子在1/2MS培养基上培养10-15天，待其长成15-20cm高的幼苗；培养条件：25℃，光照12h，黑暗12h，光照强度：8000Lux；

（3）取水稻幼茎，剥去叶鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入渗透剂，暗条件放置20-30分钟；所述渗透剂为0.3mol/L山梨醇和50mM氯化钙的混合液TVL；

（4）加入酶解液酶解细胞壁以获得原生质体；具体方法如下：在室温22-25℃条件下，将酶解液加入的水稻幼茎和渗透剂的混合液中，真空抽滤1h；然后置于水平摇床上60r/min摇4h；

（5）用25um的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等渗的W5溶液，4℃滤液静置30min以上，待溶液分层；

（6）吸取中层10ml的原生质体，用10mlW5溶液洗涤（100g离心5-10min，弃上清），2-3次，即获得较为纯净的原生质体；

（7）原生质体转化：以终浓度为20%的PEG为媒介，将带有35S驱动的增强型绿色荧光蛋白EGFP的质粒pSTAN1转化进入原生质体：转化体系如下：10ul质粒，100ul原生质体用MMG溶解，110ul40%的PEG-Cacl₂；室温放置5-15min，然后加入W5溶液至反应体系的总体积为1ml以终止反应；100g离心5min，去上清；再加入1ml W5悬浮原生质体，于25℃黑暗条件下培养2-24小时。

所述的消毒方法如下：体积百分比为70%酒精洗30s；蒸馏水洗一次；体积百分比为50%NaClO摇洗30min；灭菌蒸馏水洗8-10次。

所述的酶解液为3%纤维素酶R-10和0.6%果胶酶R-10、1M蔗糖、pH5.7的0.2M MES、1M二水氯化钙、2M氯化镁配制成的混合液，55℃温育10min，使蛋白酶失活，冷却后过滤除菌。

转化时，原生质体需预先在冰上放置30min，然后加入MMG溶液悬浮，MMG由4mMMES pH5.7，0.4M Mannitol，15mM MgCl₂组成，转化采用的媒介为PEG，由40%PEG4000，0.2M Mannitol，100mM CaCl₂组成。