[发明专利]一种不对称菁染料化合物及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种在FRET中作为淬灭剂使用的化合物，更进一步而言，本发明涉及作为淬灭剂的菁染料化合物，试剂及其在FRET中的应用。

（二）背景技术

核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一，可以用来对遗传疾病进行诊断，人体鉴定，微生物鉴定，亲子鉴定，近年来正逐渐用于病毒的特异，敏感和快速诊断。

核酸杂交技术一个很重要的方面是对杂交的探测，一个经常使用的工具是荧光寡核苷酸探针，一种特别有用的荧光探针类型是自淬灭探针，此探针包括了报告染料和淬灭染料，二者之间通过荧光共振能量转移（FRET）过程发生作用。尽管使用该基序的不同探针的设计可能在细节上存在差异，FRET探针含有连接到寡核苷酸上的荧光团和淬灭剂。

实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光信号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

荧光染料广泛用于生物学研究和诊断，荧光染料优于常规的放射性材料，因为荧光染料通常具有足够的检测灵敏度，廉价并且无毒，具有可区分颜色范围的各种荧光团使得能平行检测多种生物学靶标的多重实验更加可行，在体外和体内描述不同生物学靶标之间在空间和时间上的关系常要求能平行显示多个靶标。此外，大量荧光染料为进行高通量和自动化试验打开了新的通道。而在基于DNA的FRET检测中，FAM以其完美匹配的光源，廉价的成本，高度的稳定性，较高的量子产率成为各种检测中最常用的报告染料，特别是在实时荧光定量PCR技术中的应用更加广泛。

而作为与FAM相匹配的淬灭基团，目前大部分为偶氮染料淬灭剂，即暗淬灭剂，这类淬灭剂不占据发射带宽。并且大部分能够多路复用。一种典型的暗淬灭剂是DABCYL（4-[[4-（二甲氨基）-苯基]-偶氮基]-苯甲酸），它常常与分子信标联用。DABCYL在380～530nm的范围内淬灭染料。因此，即使具有较长发射的荧光团（例如Cy3-染料）也可被DABCYL更好的淬灭。然而，DABCYL具有不适当的吸收谱带，与在488nm以上发射的荧光团的重叠非常差。又一种非荧光染料为Eclipse淬灭剂（4-[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺，Epoch Biosciences，Inc.）它在530nm处吸收最大，并且有效淬灭从520nm到670nm的光谱。

对上述暗淬灭剂的一种改进为Black Hole淬灭剂，例如BHQ-1([4-(2-硝基-4-甲基-苯基)-偶氮基]-基-（（2-甲氧基-5-甲基-苯基）-偶氮基）)-苯胺）（为Biosearch Technologies，Inc.），它能够淬灭可见光谱，这些非荧光常用作荧光受体的替代物，目的是为了降低背景荧光并以此提高灵敏度。

然而，已知的非荧光淬灭剂的缺点是其淬灭功效不足，这导致了高背景信号，进而又导致了信号动力学特征受到限制。

（三）发明内容

本发明的目的是提供新的淬灭剂，其具有低背景信号和/或高淬灭功效。本发明提供一种不对称菁染料的荧光淬灭剂化合物，可有效淬灭FAM的荧光，令人意想不到的是，而且此种菁染料化合物显示出与未淬灭前相似的与DNA结合的功效，即可以稳定DNA双链，这样就可以PCR过程中解链温度增加，即Tm值升高。

本发明涉及下式I的化合物：

一种不对称菁染料化合物，其结构如式（I）所示：

式（I）中：

R₁为-H、-NO₂、-OH或C1～C4烷基；

R₂为-H、C1～C4烷基、苯基或卤素取代苯基；

R₃、R₄为-H、C1～C4烷基或活性基团，并且R₃、R₄中至少一个为活性基团。

所述活性基团是指可以与其它化学基团反应而形成共价化学键的基团，在合适的反应条件下具有共价活性，是与其它底物连接的点，包括亲电、亲核和光活性基团。

本发明化合物是具有化学活性和可以被至少一个活性基团取代的，活性基团的功能是作为连接其它部分的位点，此处活性基团与载体或者固相支撑物上的合适的活性基团进行化学反应。