[发明专利]一种黄连木植株性别鉴定方法

权利要求书

1.一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取黄连木植株分生组织进行染色体制片；

（2）对上述制片进行染色标记处理，镜检并采集图像；

（3）依据染色体特征利用染色体图像分析系统对上述采集图像中的染色体进行排序和编号，构建获得植株染色体核型；

（4）观察雌雄植株染色体核型差异，实现性别鉴定，其中，由15对形状特征一致的染色体组成的染色体核型为雌株核型，由14对形状特征一致的常染色体和1对形状特征有差异的异型同源染色体组成的染色体核型为雄株核型。

2.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤（1）的染色体制片，包括以下步骤：

1）、取黄连木植株分生组织在卡诺氏固定液中固定1～3天，然后移至体积分数为50～80%的酒精中保存备用，卡诺氏固定液为体积比为3：1的无水乙醇与冰醋酸的混合液；

2）、用镊子取小块组织，放在载玻片上，滴上一滴体积分数为30～60%的醋酸，盖上盖玻片，用解剖针轻压，使材料分散成一薄层，酒精灯火焰上烘烤，用拇指压平盖玻片；

3）、放置相差显微镜下观察，选择染色体清晰，数量完整，分散均匀，无断裂重叠现象的制片于-80℃冰箱中储存，冷冻12h以上备用。

3.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤（1）的分生组织选自根尖、芽尖和花序分生组织中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤（2）的染色标记处理为吉姆萨染色，包括以下步骤：

a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后，用100%酒精浸泡过夜，再用0.1～0.3M的HCl在40～70℃水浴中浸泡2～5分钟；

b、放在装有蒸馏水的染色缸中，流水中冲洗3～5次；

c、将制片转移至装有Ba(OH)₂饱和液的染色缸中，30～40℃温箱中温浴3～20分钟，自来水冲洗1～5次；

d、再转移至2×SSC缓冲液的染色缸中浸泡10～60min，自来水冲洗1～5次；

e、用吉姆萨染色液染色30～60min，加盖玻片，镜检并采集图像。

5.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤（2）的染色标记处理为DAPI染色，包括以下步骤：

a、将储存的制片取出，迅速揭开盖玻片后用体积分数为30～60%的醋酸溶液冲洗制片；

b、依次转移至体积分数为70%、95%、100%的酒精中梯度脱水，各1～10min，晾干；

c、加300～500ul的100ug/ml的DAPI染色液，染色2～5min；

d、DAPI缓冲液冲洗，晾干，加盖玻片，荧光显微镜下镜检并采集图像，其中，所述DAPI缓冲液为体积比为8：5的0.1mol/L柠檬酸溶液与0.1mol/L磷酸氢二钠溶液的混合液。

6.根据权利要求1所述的一种黄连木植株性别鉴定方法，其特征在于，所述步骤（3）的染色体特征包括染色体的长度、着丝点位置、臂比和有无随体。