[发明专利]一种使p-JNK和p-P38去磷酸化的结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA

说明书

技术领域

本发明涉及一种使p-JNK和p-P38去磷酸化的结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA，属于细胞生物学领域。

背景技术

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的古老疾病，它与艾滋病、疟疾并称为当今世界威胁人类健康的三大传染病。研究表明结核分枝杆菌基因组共编码11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/threonine protein kinase，STPK）和两种真核样酪氨酸磷酸酶（PtpA和PtpB），它们在结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞的过程中可被分泌至宿主细胞的胞质中，这些蛋白分别与宿主细胞中不同的蛋白分子相互作用，并且通过调控宿主细胞中各个靶蛋白的磷酸化水平来达到干扰真核生物信号通路的目的。

结核分枝杆菌在宿主细胞内分泌的PtpA蛋白属于低分子量酪氨酸磷酸酯酶家族，也叫做Low MW PTPs。PtpA蛋白与真核细胞中的酪氨酸磷酸酯酶有很强的相似性，因此它在病原宿主互作过程中必然会起着重要的作用。PtpA蛋白与宿主中两个蛋白分子（包括自噬相关蛋白VPS33B和V-ATPase复合体的H亚基）存在相互作用，从而干扰宿主细胞的自噬过程以及对结核分枝杆菌的清除作用。除此以外，有关PtpA蛋白对细胞信号通路影响等方面的研究还是一个空白。

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）级联反应通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。JNK和P38信号转导通路是MAPK通路的两个重要分支，它们在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用，而JNK和P38蛋白激酶分别是两个信号通路的中的关键调控因子。当外界有细胞因子（TNFα，IL-1）、生长因子（EGF）、特定抗原，以及紫外线和放射线等存在时，JNK和P38蛋白就会接受上游信号分别被磷酸化活化成p-JNK和p-P38，并且进一步磷酸化激活下游蛋白，进而激活信号通路，调控目的基因的转录水平。已有大量实验证实JNK和P38蛋白激酶的活性与多种病理过程及重要疾病密切相关，包括：炎症反应、缺血/再灌注损伤、神经退行性疾病、肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病以及肿瘤。因此，JNK和P38可作为潜在的分子治疗靶点，应用JNK和P38抑制剂进行多种疾病的治疗将可能取得很好的临床效果。

本发明旨在提供一种能使p-JNK和p-P38去磷酸化的酶，进而抑制p-JNK和p-P38的激酶活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种使p-JNK和p-P38蛋白去磷酸化的结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA，其氨基酸序列如（a）或（b）或（c）：

（a）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有磷酸酯酶活性的由（a）衍生的多肽或其类似物；

（c）与（a）、（b）中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a）衍生的多肽或其类似物。

所述PtpA能抑制或调控p-JNK和p-P38的激酶活性，并能应用于抑制或调控JNK和P38信号转导通路。

所述用于体外实验的PtpA蛋白制备方法是构建含有PtpA基因的重组质粒pGEX-6P-1-PtpA，并将质粒转化到大肠杆菌BL21中，以IPTG诱导蛋白表达；超声破菌，高速离心后收取上清液；将上清液缓缓流过填充好的Glutathione-Sepharose beads（GE）中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入含有谷胱甘肽的洗脱液洗脱蛋白；将收集的洗脱液加入到30KD的蛋白浓缩管（millipore）中，3500rpm离心浓缩20min；在蛋白浓缩管中加入PBS混匀后离心；分装蛋白，-80℃保存待用。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种泛素蛋白分子（Ubiquitin）用于有效提高PtpA的磷酸酯酶活性，其氨基酸序列如（d）或（e）或（f）：

（d）SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

（e）在（d）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有促进PtpA磷酸酯酶活性的由（d）衍生的多肽或其类似物；

（f）与（d）、（e）中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（d）衍生的多肽或其类似物。