[发明专利]表达传染性支气管炎病毒S1蛋白的重组新城疫疫苗株rAI4-S1及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及应用反向遗传技术，拯救一株以新城疫病毒为载体表达传染性支气管炎病毒S1蛋白的重组疫苗株rAI4-S1，用于研制疫苗。

背景技术

反向遗传操作技术（Reverse genetics manipulation technique）:对于RNA病毒而言，反向遗传技术是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。[Neumann G,Whitt M A,Kawaoka Y,et al.(2002).A decade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA–what have we learned?J Gen Virol.83(11):2635-2662.]。新城疫病毒反向遗传技术是在参照其它单股不分节段的负链RNA病毒（NNSV）的反向遗传学操作技术的基础上建立起来的。1999年Peeters等[Peeters BPH,Olays,oe Leeuw,Koch G,et al.(1999).Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA:Evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.J Virol.73:5001-5009.]和Romer-Oberdorfer等[Radecke F,Spielhofer P,Schneider H,et al.(1995).Rescue of meales virus from cloned DNA.EMBO J14:5773-5784.]几乎同时首次报道了新城疫病毒的成功拯救。

新城疫（Newcastle disease），又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟等。是由新城疫病毒引起的，主要感染鸡、鸽、鹌鹑、火鸡等家禽和野生禽类的一种急性、败血性、高度接触性传染病。可感染240种以上的禽类，世界各国都十分重视该病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为动物法定必报传染病。新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是单股、不分节段的负链RNA病毒，属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属成员。按照标准的致病性指标可以将病毒分为速发型（强毒）、中发型（中等毒力）和缓发型（弱毒）。基因组长度大约15kb，其结构为3’-leader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）、磷蛋白（Phosphoprotein,P）、基质蛋白（Matrix protein,M）、融合蛋白（Fusion protein,F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein,L）。其中F蛋白具有诱导细胞融合、破坏细胞的作用，F蛋白是不同NDV毒性强弱的主要原因，并且F蛋白的裂解位点起到了重要作用。[Peeters BP,et al.Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA:evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.Journal of Virology,1999.73（6）:p5001-9.]。

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由病毒引起的鸡急性、高度接触性传染性的呼吸道等疾病，其特征为病鸡咳嗽、喷嚏，发出气管啰音，在雏鸡还可以出现流涕，产蛋鸡出现产蛋减少和质量变质的现象，造成养禽巨大的经济损失[殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京:科学出版社,1997,675-680.]。S蛋白对IBV侵染性起着重要作用，当病毒粒子启动对敏感细胞感染时，首先是IBV毒粒囊膜的S蛋白与敏感细胞的受体相结合，通过病毒囊膜和细胞膜的融合或内吞饮作用进入细胞。