[发明专利]仔猪大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的高表达生产工艺及其提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及大肠杆菌纤毛抗原的生产工艺及其提取方法。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起幼龄家畜腹泻的主要病因之一（Vu Khac H,Holoda E,Pilipcinec E,et a1.Serotypes,virulence genes,and PFGE profiles of Escherichia coli isolated from pigs with postweaning diarrhoea in Slovakia[J].BMC Vet Res.2006,2:10），而其致病作用与黏附性纤毛和肠毒素密切相关。ETEC菌株是通过细菌的纤毛与宿主小肠上皮细胞表面的相应受体结合，从而在该局部组织黏附、定居、繁殖和产生毒素，导致腹泻（Jeyasingham M D,Butty P,King T P,et a1.Escherichia coli K88receptor expression in intestine of disease-susceptible weaned pigs[J].Veterinary Micmbiology.1999,68(3-4):219-234）。引起仔猪腹泻的纤毛抗原主要是K88、K99、987P和F41（Fairbrother J M,汪铭书.从腹泻病新生仔猪分离的非传统血清型Ecoli的纤毛抗原和肠毒素检测[J].国外兽医学—畜禽传染病,1989,9(3):26-28）。

纤毛抗原具有良好的免疫原性，免疫机体后能产生相应的纤毛抗体，对产肠毒素大肠杆菌具有免疫作用。由于幼畜起病早、发病快，利用纤毛抗原免疫怀孕母猪，产生特异性纤毛抗体，仔猪可通过被动免疫途径获得保护。

研制有效的纤毛抗原疫苗最重要的是获得大量表达纤毛抗原的产肠毒素大肠杆菌，并将纤毛抗原从菌体上提取出来。巫月生等（巫月生，齐冬梅，张毓金等，猪K88、K99、987P、F41埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨，《中国兽医杂志》，2011年，45（5）:8-10）采用高密度发酵培养，用反向间接血凝试验测定纤毛抗原的效价，可达到2¹¹-2¹³。常采用的大肠杆菌菌毛提取的方法有4℃万能混合器混合法，60-65℃水浴振荡法，4℃组织捣碎法，冰浴匀浆法，4℃高速搅拌法。

纤毛抗原的表达除与菌株、培养基组成等有关外，培养方法亦至关重要。因此，研究高效表达纤毛抗原的产肠毒素大肠杆菌的生产工艺具有十分重要的现实意义。

发明内容

大肠杆菌在发酵过程中，碳源和氮源是决定发酵效果的关键因素，大肠杆菌对碳源和氮源的需求是变化的而不是一成不变的，在发酵过程的菌体生长阶段，随着菌体浓度的增长，菌体所需的碳氮比呈现越来越高的趋势。因此，在基础培养基的基础上，根据发酵不同时期，通过补料实时调控碳源、氮源平衡，进行大肠杆菌高密度发酵培养，同时获得高表达量的纤毛抗原，是研究的核心内容。

本发明的目的之一，筛选合适的氮源用于补料，获得高表达纤毛抗原的大肠杆菌培养物。

为了实现上述目的，通过不同的氮源（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨）进行筛选，最后确定优选为胰蛋白胨。

本发明的另一目的是，对碳源（葡萄糖）和氮源之间的添加量的最佳实施方案进行了摸索。

培养过程中，以初始培养基体积计，大肠杆菌C83549、C83644、C83710补充葡萄糖8-30g/L，优选为12-25g/L，补充胰蛋白胨8-20g/L，优选为10-16g/L。

本发明的另一目的在于提供一种高效表达仔猪大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的生产工艺，包括下述步骤：按照发酵罐体积70%加入改良Minca汤培养基，以培养基体积计，加入0.1%（v/v）的消泡剂，高压灭菌后，待培养基温度降至35-37℃，再按1%-5%（v/v）的接种量加入产纤毛抗原的大肠杆菌种子培养物，培养温度37℃，搅拌速度300-450r/min，通气量为6-9L/min，培养过程中自动补加氨水，使菌液pH值维持7.2左右，控制溶氧20%以上，以初始培养基体积计，补充葡萄糖和胰蛋白胨分别为8-30g/L、8-20g/L，培养6-9h制备大肠杆菌菌液。