[发明专利]中国人群HLA特异慢粒白血病表位疫苗

权利要求书

1.中国人群HLA特异慢粒白血病表位疫苗，其特征在于：将序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸插入到穿梭质粒PRNAiU6.2中，构建穿梭质粒，然后进行慢病毒的包装与纯化，即得到中国人群HLA特异慢粒白血病表位疫苗。

2.权利要求1所述的中国人群HLA特异慢粒白血病表位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸插入到穿梭质粒PRNAiU6.2的Sma I和Kpn I多克隆位点之间，构建穿梭质粒PRNAiU6.2-DWH；

（2）成功构建穿梭质粒后，进行慢病毒的包装与纯化，得到慢病毒液，即为中国人群HLA特异慢粒白血病表位疫苗；慢病毒的包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G，PRNAiU6.2-DWH。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述慢病毒包装与纯化的具体步骤如下：

1）慢病毒包装细胞转染：用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，细胞密度为0.5×10⁶/cm²时，重新接种于细胞培养皿，37℃，5%CO₂培养箱内培养；

2）制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液：取pRsv-REV10μg、pMDlg-pRRE15μg、pMD2G7.5μg和PRNAiU6.2-DWH20μg，加入无菌水定容至1800μL,再加入2.5mol/L的CaCl₂溶液200μL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000μL，室温放置20～30min，得DNA和磷酸钙混合液，备用；

3）当步骤1）中的细胞密度达60%～70%时，进行转染：将步骤2）的DNA和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12h后弃去含有转染混合物的培养液，加入PBS15mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次；

4）每瓶细胞中加入含100mL/L小牛血清的DMEM细胞培养液15mL，继续培养48h；

5）收集转染72h的293T细胞上清液；

6）将步骤5）收集的细胞上清液于4℃，4000g离心10min，收集上清液；

7将步骤6）收集的上清液以0.45μm滤器过滤；

8）将步骤7）过滤后的上清液于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20min；

9）步骤8）离心后，以冰500ulPBS重悬病毒沉淀，于4℃溶解过夜，即得到慢病毒液，即为中国人群HLA特异慢粒白血病表位疫苗。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，细胞培养皿中的生长培养基为含10%FBS的DMEM培养基。