[发明专利]大豆疫霉特异性的分子检测引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及一种用于大豆疫霉特异性的分子检测引物及其应用。

背景技术

大豆是世界上重要经济农作物，大豆疫霉(Phytophthora sojae）侵染大豆而引起幼苗猝死和成株的根腐病是世界大豆生产上的主要病害之一，每年给世界大豆产业带来巨额经济损失。大豆疫霉菌可以在大豆生长的各个时期侵染大豆，在潮湿多雨的季节病害发生尤其严重，由于大豆疫霉以同宗配合的方式进行有性生殖，在发病植株上可以产生大量的卵孢子，植物收获后残留在土壤中的卵孢子就成为大豆疫霉的初侵染源，据报道大豆疫霉的卵孢子可以在土壤中存活5年以上。因此大豆疫霉根腐病一旦发生将很难消除。大豆疫霉是我国对外公布的A1类进境植物检疫对象。1948年，美国的印第安那州首次发现了该病原菌的存在，并与1955年公开报道，该病害在美国、巴西等世界大豆主要生产国家和地区均发生严重，每年给全球大豆生产造成的直接经济损失达到10-20亿美元。

1989年沈崇尧等首次在我国东北地区发现了大豆疫霉根腐病的存在, 1993年苏彦纯等首次报道了我国黑龙江大豆主产区发生大豆疫霉根腐病，此后在我国北方的大豆主产区陆续发现该病害的发生，近年在以生产鲜食毛豆为主的福建大豆产区也发生了大豆疫霉根腐病。黑龙江省植保站1997、1998两年对黑龙江省大豆疫病发生情况进行普查，结果表明仅黑龙江省发病面积已超过 30万公顷。由此可见，该病害已经对我国的大豆生产产业带来巨大危害，是一个急需解决的问题。

近年来，随着我国大豆需求量的加大，从美国等国家进口的商品大豆日趋增多，每年进口大豆的数量几乎超过了国产大豆年生产量的总和，而这些国家大豆疫霉病害的发生普遍较严重。由于大豆疫霉是典型的土传病害，卵孢子能在土壤中长期生存，而进境大豆中所夹带的土壤极有可能携带大豆疫霉病菌，增加了大豆疫病传播扩散的风险，这种严峻的形势下，快速准确地检测病原菌和诊断病害是控制病害成灾的主要措施之一。同时采用定量检测的方法，检测土壤中残存的病原物含量，可以为预报预测提供具体的数据。

大豆疫霉的传统检测方法是用大豆叶碟从土壤中进行诱捕和平板培养或者将二者相结合，传统方法在大豆疫霉检测及菌株分离中发挥了重要作用。但大豆疫霉病原菌与其他疫霉菌的形态特征非常相似，以形态特征为基础的传统检测方法需要20天左右才能确定进口大豆中是否带菌，而且该方法要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，从而导致经常出现漏检，无法满足田间疫情调查和海关检疫的要求。时间长，技术要求高，导致效率低。

从聚合酶链式反应（PCR）发明以来，便以其快速灵敏的特性成为动植物病原物检测最重要的方法。伴随着各个病原物基因组测序的完善，很多特异性的核酸序列被用来作为PCR反应特异性靶标，可以更加准确地对病原物进行鉴定。发展分子检测最重要的一点就是选用合适的分子检测靶标。目前广泛采用的靶标是基于核糖体转录间隔区域（ITS）序列，ITS序列具有物种间高度变异和种内保守的特性，这使得ITS序列可以在物种的各个分类水平上进行区分。但是，伴随着现代分子生物学的快速发展，各个物种基因组序列的不断公布，发现很多不同种的ITS序列具有很高的相似性，使用ITS序列很难将这些种区分开。而且由于ITS在基因组中是多拷贝的，并不适合开发定量检测方法。因此必须开发出更多的分子检测靶标以满足植物病原菌分子检测的需要。随着疫霉基因组学的发展，不断有新的分子靶标被发现并用于分子检测。elicitin基因被用来作为疫霉菌检测的标靶，Ras家族相关的编码基因Ypt1被广泛用于疫霉菌的分子检测，线粒体编码基因Cox1、Cox2和可能编码储存蛋白的Lpv基因分别作为橡树疫霉（P. ramorum）和樟疫霉（P. cinnamomi）检测的靶标。

本发明旨在寻找大豆疫霉中新的分子检测靶标基因，并利用该基因设计出大豆疫霉特异性的检测引物，开发出大豆疫霉实时定量PCR的检测方法。Ykt6p是一个细胞存活必须的R-SNARE蛋白，Ykt6在真核生物的进化上非常保守，将不同物种中的Ykt6氨基酸序列进行比对分析，结果表明，在系统进化上疫霉和植物及藻类在亲缘关系上比真菌更近，这与疫霉的分类地位完全符合。由此我们将Ykt6作为一个新的分子检测靶标，通过序列比对分析设计出了大豆疫霉特异性的分子检测引物，并在此基础上开发出了大豆疫霉实时定量PCR的检测方法。

发明内容