[发明专利]从血液中分离、培养细胞的方法及进行克隆非人动物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及从血液中分离、培养细胞的方法及克隆非人动物的方法。

背景技术

体细胞核移植又称克隆，是动物细胞工程最常用的技术手段。通过电击法或直接显微注射法将分化程度较高的体细胞转移至卵母细胞中，再经过化学激活，使其重新编程发育成胚胎，将其移植回代孕母体内，出生完整个体。传统的体细胞核移植技术需要昂贵、精密的显微操作系统，对操作人员的技术要求很高，不适用于大规模的克隆动物生产。

2001年，丹麦科学家Gabor Vajta首次提出了手工克隆技术，该技术最大的关键点是利用刀片实现“切割去核”，从而完全摆脱显微操作系统，降低了克隆这项技术的仪器投入以及人工支出成本，使克隆这项技术应用于未来的产业化成为可能。目前体细胞核移植的囊胚率在20%-30%之间，而手工克隆动物囊胚率能提高至40%-60%。

由此，目前用于体细胞移植的供核细胞来源仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。

本发明是发明人基于如下事实发现的：近年来，克隆动物越来越具有其广阔的应用前景，例如可用于优质畜种的培育，以有利于濒危动物种质资源保存；生产各类实验动物，由此获得实验动物具有遗传物质均一性、表型一致性等特点，更适用于药理学各项研究；将克隆运用于转基因，可高效率得到转基因动物，缩短实验周期，大量获得转基因动物。在体细胞核移植的过程中，供体细胞种类繁多，包括具有多潜能性的胚胎干细胞、脂肪间充质干细胞，以及终端分化细胞成纤维细胞、肝细胞、颗粒细胞、肝脏细胞等。胚胎干细胞来源于囊胚期的内细胞团，在饲养层细胞上培养可超过上百代，但是操作繁琐，不适于大规模建系传代，并且由于其来源的特殊性，无法得到成体动物的相关信息，对于优质种系克隆具有一定局限性；而骨骼来源的间充质干细胞贴壁细胞，主要是通过分离动物股骨中的骨髓而得到目标细胞，但采用此方法收集的样品，需要将动物先处死以方便进行采集；其它来源的用于供核细胞，在不同程度上都会对动物个体造成组织、器官创伤。目前成纤 维是最为常用的克隆体细胞类型，但是对于猪、牛、羊等大动物，基本都是采集其耳缘组织在体外进行原代培养，但是由于其本身的生长环境因素等原因，样品采集很难保证无菌，后期在体外培养制备过程中细菌、真菌污染的概率很高。

为此，本发明的一个目的在于提出一种对动物的应激刺激少、伤害小，保证动物外观完整的从血液中分离、培养细胞的方法。该方法包括以下步骤：将所述血液加入到分离液上层后利用密度梯度离心的方式进行离心，以便获得单个核细胞；将所述单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞；以及将所述贴壁细胞进行传代培养，以便获得体细胞核移植的供体细胞。通过根据本发明实施例的从血液中提取、培养细胞的方法制备的体细胞核移植的供体细胞用于手工克隆体细胞核移植，囊胚效率在最高可达55%，平均囊胚率在40%左右。由此，根据本发明实施例的从血液中分离、培养细胞的方法不仅操作过程简单、易于实现、成本较低，且该方法对动物应激刺激少、伤害小，可以保证动物的完整外观、改善动物福利。

另外，根据本发明实施例的从血液中分离、培养细胞的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述血液来自外周血。由于外周血采集操作相对简单、对动物应激刺激少、伤害小，由此不仅可以改善动物福利，且血液与外界相对较为封闭，后期细胞培养污染率基本为零，提高了细胞成活率。

根据本发明的实施例，所述分离液为中性粒细胞分离液。由此，可以有效地通过利用密度梯度离心的方式将血液中的各种细胞成分按照密度的大小进行分离，经过离心操作血液被分为若干层，每层中含有不同的血液细胞成分，从而有效地得到单个核细胞。

根据本发明的实施例，所述中性粒细胞分离液的密度为1.077g/mL，其中，所述中性粒细胞分离液含有57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸钠。由此，含有上述成分的中性粒细胞分离液提高了分离血液中不同细胞成分的分离效率，从而可以有效地从其中单核细胞层获得血液中的单个核细胞。

根据本发明的实施例，所述单个核细胞是从所述分离液离心后中间层收集的。利用密度梯度离心的方式将血液加入上述分离液中进行离心分离后，血液在上述分离液中被分为若干层，每层中分别含有不同细胞成分，由此，可以直接从中间层收集单个核细胞，不仅实验操作过程简单、易于实验，且分层后的每层中的细胞成分单一，由此提高了单个核细胞的分离效率。