[发明专利]一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法。

背景技术

茄子（Solanum melongena Linn），属于茄科（Solanaceae）茄属（2n=2x=24），起源于亚洲东南亚热带地区，是欧洲、亚洲和北美洲的重要蔬菜品种之一。它不仅具有较高的营养价值，且食用方法多样，是一种可以干鲜结合、周年供应、经济实惠的大宗蔬菜，深受广大生产者和消费者的欢迎。中国是世界上最大的茄子生产国，因此，茄子的遗传育种工作对于实际生产意义重大。

在茄子杂交育种工作中，自交系的选育是非常重要的工作，但往往存在选育周期长、选择效率低等问题。单倍体育种可以大大提高后代选择的效率，缩小育种群体规模，缩短育种年限，加快育种进程。

花药离体培养是以花药为外植体，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，诱导其分化出愈伤组织或胚状体，随后使愈伤组织分化成完整的植株。花药培养不需要分离出花粉，程序比较简化，因而是诱导人工单倍体的主要方法之一。

利用花药培养可快速获得纯系和突变体，创新种质资源，对茄子遗传育种及品种改良具有重要意义。70年代初，Riana等成功通过茄子花药培养经愈伤组织途径成苗。茄子不论是花药还是花粉培养，都已有一些成功的报道。目前，有关茄子花药培养的研究大多集中在如何提高愈伤组织和胚状体的诱导频率上.而对从愈伤组织诱导产生单倍体植株的研究则很少。许多愈伤组织不能正常的生长发育而只产生根，不分化芽，成苗率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有花药培养技术中愈伤组织诱导率和分化率低，培养效果差的问题，是在于提供了一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法，应用本方法获得愈伤组织的几率高，愈伤组织分化频率高，培养效果好。将本发明花药培养方法及配套培养基应用于茄子遗传育种中，可以大大提高了茄子花药培养效率，丰富了茄子优良基因型个体，完善了茄子单倍体育种途径，缩短了育种周期，为加快茄子遗传育种和茄科作物花药离体培养研究提供技术和理论依据。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法，其步骤是：

1）从茄子花期开始，于晴天上午9:00-10:00从健壮植株上选取发育正常，表面无损伤，经显微镜镜检小孢子处于单核中期至单核靠边期的花蕾用于花药培养，对应花蕾外部形态为花冠低于花萼裂基部1mm-2mm至花冠高于花萼裂基部1mm-2mm，花药为黄绿色；

2）将花蕾装于自封袋内置于4℃-5℃冰箱预处理24h-72h；

3）将花蕾外萼剥掉，再用75%（体积百分比）的酒精表面消毒28s-32s，之后用5%（质量百分比）的次氯酸钠溶液消毒15min-20min，然后用无菌水冲洗3-4次；

4）在无菌滤纸上用镊子剥取花药，将花药柄去除干净，接种于装有愈伤组织诱导培养基的培养皿（90mm）中，每皿接种3-5个花蕾的花药；

5）花药接种后，置于35℃-37℃高温黑暗条件下处理6d-7d；

6）于光照强度15001x-20001x、光照时间12h-16h、温度25℃-28℃下继续培养，3周左右产生愈伤组织；

7）待愈伤组织长到直径为5mm-6mm时，切下并接种到愈伤组织增殖培养基上培养增殖；

8）两周后，选取大小一致，色泽新鲜，淡黄色，质地紧密的愈伤组织转移至愈伤组织分化培养基上，诱导不定芽发生；

9）待芽苗长至1cm-3cm长时，切下无根小苗，转接到植株扩繁与继代培养基上，每30d扩繁继代一次；

10）根据育种需求和外界环境条件，在移栽大田前1个月将无根小苗转移至生根培养基上，诱导生根，再生出完整植株。

上述步骤4)、7)、8）、9）、10）中培养基的组分及配比如下：

愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基，0.5mg/L2，4-D，1.0mg/L KT，8mg/L VC，30.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

愈伤组织增殖培养基：MS基本培养基，30.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L，灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；

愈伤组织分化培养基：MS基本培养基，0.01mg/L NAA，2.0mg/L ZT，20.0g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，加水至1L；灭菌前调整培养基的pH至5.8-6.0；