[发明专利]中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程，尤其是涉及一种中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用。

背景技术

进入21世纪，水产养殖业向多品种、高投入、高密度、集约式、工厂化的方向快速发展，但频繁暴发的传染性病害时刻威胁着该产业的健康可持续性发展。目前，水产养殖生物病害防治主要方法有药物防治、免疫防治和生态防治等，并逐步向高效、低毒、无残留和无公害的方向发展。而化学药物仍是目前水产动物病害防治最直接和最有效的一种手段。我国渔药产业基础薄弱、水产养殖生物病害防治技术滞后与养殖户用药知识匮乏等因素，导致大部分养殖户使用价格低廉、残留严重的农药及化工原料，造成了水体的严重污染。此外，抗生素、激素类等药物在水产养殖过程中的应用，虽然对病害控制起到一定作用，但在很大程度上破坏了水环境及动物体内的微生态平衡，使水产动物失去了正常的菌群屏障及生物拮抗作用，进而导致外源性效应菌和内源性致病菌大量增殖，由此造成了潜在的更大病害。滥用药物将导致致病菌株产生耐药性，变异出致病性更强、危害性更大、流行性更广的致病微生物,长期使用化学药品势必导致病原生物抗药性的增加。随着科技的发展和人类经济文化水平的提高，人们对食品安全和环境安全提出了更高的要求，化学药物正逐渐被生物制品所替代。

作为一种无脊椎动物，中国明对虾依靠其仅有的先天免疫系统实现对外界病原微生物的免疫。中国明对虾在海水这一复杂微生物环境中的正常生长、繁殖，说明其免疫系统能够有效抵御外界病原微生物的侵袭。抗脂多糖因子（anti-lipopolysaccharide factor，ALF）是一种脂多糖结合蛋白，是鲎、蟹虾类等甲壳动物体内中广泛存在的一类抗菌肽，通过结合脂多糖，调节细胞的脱颗粒作用，引起一系列级联反应，从而在甲壳动物的体液免疫中发挥着重要作用。在前期研究中，申请人所在项目组从中国明对虾血细胞中克隆到ALF全长cDNA序列（FcALF），研究发现在鳗弧菌等病原刺激下，FcALF在mRNA水平上的表达发生剧烈变化，提示FcALF在对虾应对外界病原感染过程中，发挥着重要作用（Liu,FS,等，Marine Biotechnology，2005,7（6）:600-608）。

发明内容

本发明目的在于提供一种中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种中国明对虾抗脂多糖因子FcALF，中国明对虾抗脂多糖因子FcALF基因为

(a)由SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示的蛋白质，或者

(b)在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由（a）衍生的蛋白质。

中国明对虾抗脂多糖因子FcALF重组蛋白的制备方法：

(a)构建中国明对虾抗脂多糖因子重组表达载体pPIC9k-FcALF；

(b)将步骤（a）所得重组表达载体经线性化后导入宿主细胞，结合抗生素G418和PCR的方法进行阳性克隆的筛选，并对获得的阳性克隆进行诱导表达，获得表达产物；

(c)分离纯化步骤（b）所得的表达产物，即获得重组的SEQ ID NO.1序列所示氨基酸的蛋白（即rFcALF）或SEQ ID NO.1序列所示的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由SEQID NO.1中氨基酸序列所示的衍生的蛋白质。

所述步骤（b）中宿主细胞为毕赤酵母。

中国明对虾抗脂多糖因子FcALF的应用：所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备广谱抗菌类药物。

所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备革兰氏阴性菌的抗菌类药物。

所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备免疫增强剂、保健品或饲料添加剂。

本发明所具有的优点：本发明选取毕赤酵母作为真核表达系统，对中国明对虾抗脂多糖因子（FcALF）进行重组表达。同时分析了其抗菌活性，为抗菌药物与免疫增强剂筛选提供了指导。具体的说本发明中国明对虾抗脂多糖因子重组蛋白对革兰氏阴性菌大肠杆菌具有明显抑制生长作用和杀菌作用。本发明重组蛋白对大肠杆菌具有很强的抑制生长作用，最小抑制浓度为3.12μg/mL。

附图说明