[发明专利]一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法

说明书

技术领域

本发明属于植物培育技术领域，涉及一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法。

背景技术

喜树(Campototheca acuminate Decaisne)为珙桐科落叶乔木，我国特有树种。1966年，美国的Monroe E.WALL博士从喜树的次生代谢产物中分离得到喜树碱(Compothecine，简称CPT)。1985年，Hisang等发现CPT能阻断拓扑异构酶I的合成而具有抗癌效应。目前，已有多种以CPT为前体合成的喜树碱衍生物用于临床治疗卵巢癌、结肠癌等，另外，CPT对HIV病毒也具有较强的抑制作用。随着CPT抗肿瘤、抗病毒等功能的不断挖掘、验证，全球对CPT的需求量迅猛增加。自20世纪90年代来，美国、日本、加拿大和英国等国家积极投入大量人力物力进行喜树引种栽培和CPT研发，喜树成为红豆杉之后第2个重要的木本抗癌药用植物。但喜树中CPT含量低，单纯依靠从植株中提取CPT已不能满足市场的需求，利用植物细胞大规模培养技术生产高价值次生代谢产物在多种药用植物中取得了成功，同样，已有相关研究证实，通过喜树愈伤组织培养生产CPT是一种行之有效的途径。

光作为一个重要的环境因子，对植物的生长发育有重要的调节作用。顾青等研究了光照对喜树愈伤组织生理生化特性及喜树碱合成的影响，结果显示，与暗培养相比，光下培养可以促进喜树愈伤组织的生理代谢，且对喜树碱的合成和积累有一定的促进作用。目前，日光灯是组织培养的主要光源，但其能耗高，寿命短，含汞，易造成环境污染，且光质单一，不能满足植物在组织培养不同生长阶段对光质的需求差异。发光二级管(LED)是一种能发光的半导体电子原件，通过化学修饰方法，调整材料的能带结构和禁带宽度，可实现红黄绿蓝橙多色发光，满足植物在组织培养不同阶段对光质的需求差异，同时，LED能耗较同效的白炽灯减少80％，无有害金属汞，使用寿命可达10万小时，《国家基本公共服务体系“十二五”规划》指出要大力支持发展LED产业，在规划期间LED灯将大量替代传统日光灯在各行各业广泛推广应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出一种能有效提高喜树茎段愈伤组织诱导率和增殖率的优化培养基及LED组培光源调控方法。

一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法，包括以下步骤：

1)将选取的喜树春发新梢剪切成小段，用自来水冲洗干净，用洗衣液溶液浸泡15min，流水下反复冲洗；

2)用流水冲洗干净后，在75％乙醇溶液中浸1min，立即放人0.1％升汞溶液中消毒5min，无菌水冲洗5次后放在无菌滤纸上晾干备接种用；

3)将叶片剪成5mm×5mm，带腋芽茎段切成2mm的小段，在无菌的条件下分别接入配制好的诱导培养基MS+0.1mg／L KT+4mg／L2，4-D上，每配制1L培养基加入5.5g琼脂和30g蔗糖，调pH至5.9，将诱导培养基分装到培养瓶中，每瓶40mL，在121℃下灭菌15min，培养温度25±2℃，光照强度1000～1500lx，暗培养一周，再转入光照培养，每天光照时间12h；

4)诱导出的愈伤组织转移至新的继代培养基上继代培养，30d继代1次，继代培养基为B5+0.5mg／L KT+1.0mg／L NAA+0.5mg／L2，4-D，5.5g／L琼脂和30g／L蔗糖，pH为5.9；

5)30d继代1次，连续继代5次后，挑选疏松易碎的愈伤组织进行LED光下培养。

进一步优选，步骤5)中采用绿光微继代的光质。

本发明提供的提高喜树茎段愈伤组织增殖率的LED光源调控方法，其为在愈伤组织增殖阶段，将愈伤组织转移至光谱波长为500～580nm、光量在105μmol·m^-2·s^-1左右的LED绿光下培养。

本发明的优化培养基和LED组培光调控方法能有效地提高喜树愈伤组织诱导率和增殖率，为获得大量的CPT提取原料喜树愈伤提供了技术保证，此外，本发明还能降低能耗，降低生产成本，减少环境污染。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

以喜树当年生无病虫害的幼嫩茎段为外植体。茎段采摘清洗后，在75％乙醇溶液中消毒1min，立即放人0.1％升汞溶液中继续消毒5min，无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干水分，备用。