[发明专利]一种获得FSHR多种剪接形式全长编码区序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是获取绵羊促卵泡激素受体（FSHR）基因多种剪接形式完整编码区全序列的方法。

背景技术

研究发现促卵泡激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)是主要存在于脊椎动物卵巢颗粒细胞和精巢Sertoli细胞膜上的一种G蛋白偶联受体，在介导FSH调控个体的青春期性成熟、刺激生殖细胞成熟的生理过程中发挥着重要的作用，除此之外，FSHR还在破骨细胞（Cell.2006Apr21;125(2):247-260.），单核细胞（Biochem Biophys Res Commun.2010Mar26;394(1):12-17.），卵母细胞(J Clin Endocrinol Metab.2002May;87(5):2266-2276.)，肿瘤血管壁（N Engl J Med.2010Oct21;363(17):1621-1630.）等处也有表达，但在这些位置表达的生物学功能还不清楚。

哺乳动物FSHR共由10个外显子组成，其中前9个外显子编码胞外域，第10个外显子编码7次跨膜结构及胞内域。在哺乳动物中还发现FSHR存在多种剪辑形式。一类是7次跨膜结构域不变，而胞外域外显子多种剪接。在小鼠中可变剪接模式主要体现在缺失第2和第5外显子上（Biol Reprod.1999Jun;60(6):1515-1527，Mol Cell Endocrinol.1994May;101(1-2):197-201.）。而在牛卵巢中的可变剪接模式中主要体现在缺失第4,5,9外显子(Mol Cell Endocrinol.1996Jun18;120(1):25-30.)。在人卵巢中的剪接形式主要是缺失第2,6,9外显子及第8外显子的重复插入（J Clin Endocrinol Metab.2010Feb;95(2):529-36，Biochem Biophys Res Commun.1992Nov16;188(3):1077-1083.），在人单核细胞和破骨细胞中FSHR缺失第九外显子（Biochem Biophys Res Commun.2010Mar26;394(1):12-17.）。在绵羊中发现有缺失第8内含子的可变剪接模式（J Mol Endocrinol.1995Dec;15(3):273-281.）。另一类是在大鼠和绵羊中发现无7次跨膜结构域的可变剪接形式。例如在大鼠中的两种可变剪接形式：FSH-R1在第9,10外显子之间加入一小段额外的外显子，导致第9外显子后终止。FSH-R2在第4外显子前缺失3个碱基，在之后又连一个额外的外显子并提前终止。FSH-R1，FSH-R2均无7次跨膜结构（J Endocrinol.1998Jul;158(1):127-136.）。在绵羊精巢内发现的FSHR两种可变剪接模式，均缺乏7次跨膜结构：一是编码134个氨基酸（1-4外显子全长）的受体，二是编码259个氨基酸，前8个外显子及单次跨膜结构（BiochemBiophys Res Commun.1993Feb15;190(3):888-894.）。

FSHR的多种剪接形式可能影响其生物学功能。在牛卵巢黄体形成后，全长的剪接形式的FSHR不再表达，而另外几种剪接形式仍然存在（Mol Cell Endocrinol.1996Jun18;120(1):25-30.）。在女性卵巢中发现的四种可变剪接FSHR，三种属于外显子个别缺失，一种属于外显子插入，并且cAMP活性显著降低（J Clin Endocrinol Metab.2010Feb;95(2):529-536.）。在绵羊卵巢中FSHR剪接模式（第8内含子缺失），其mRNA在成年羊窦前卵泡期仅有一至两层颗粒细胞的腔前卵泡上有表达，直到卵泡闭锁早期；而在胎儿卵巢（妊娠100,120,135天）中，FSHR却在卵泡两层至多层的颗粒细胞上有表达，表明颗粒细胞分化期FSHR开始表达，而非原始卵泡向初级卵泡转化期表达（J Mol Endocrinol.1995Dec;15(3):273-281.）。

哺乳类性腺中不同剪接体的FSHR具体生物学功能至今还不是很清楚，可能与其物种间多样的繁殖方式有关。比如人类每月排卵一次，属单胎型；而同是哺乳类的小鼠则每8-12天即可排多个卵，属多胎型。FSHR在物种间的差异性剪接可能参与了这种多样化的繁殖模式。