[发明专利]嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法。

背景技术

嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase),简称PNP,是嘌呤补救合成途径的关键酶之一，广泛存在于哺乳动物、寄生虫和微生物中。按照嘌呤核苷磷酸化酶的蛋白结构可分为两类：低分子量的同源三聚体类和高分子量的同源六聚体类。其中哺乳动物和部分微生物（例如鼠伤寒沙门氏菌salmonella typhimurium，嗜热古菌芝田硫化叶菌Sulfolobus solfataricus等）的嘌呤核苷磷酸化酶属于同源三聚体类，其分子量约为80～100kDa，每个亚基的分子量为30～32kDa，通常此类嘌呤核苷磷酸化酶只能以鸟嘌呤核苷和肌苷作为底物。而同源六聚体类的嘌呤核苷磷酸化酶，底物专一性不强，既可接受鸟嘌呤核苷和肌苷作为底物，也可以腺嘌呤核苷作为底物。其分子量约为150kDa，亚基分子量为25kDa左右。

由于PNP特殊的生物活性，使得其在医药领域得到了较大的应用：①应用于核苷类药物的合成，大量研究表明，核苷类（核苷及其类似物）具有广泛的抗肿瘤抗病毒的效果。②应用于肿瘤靶向治疗；③应用于无机磷和ATPase酶活力等的定量测定。

鉴于PNP的广泛应用前景，近年来，关于PNP的基因工程研究越来越多，但多以大肠杆菌PNP和嗜热菌PNP为主。而本发明选取克隆假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的PNP，简称为PiPNP，其相对于其他菌属的PNP有着一个显著的优点，即该酶在低温(小于40℃)下的即有较高的催化效率，研究发现，在体外，催化低浓度或高浓度的肌苷反应时，PiPNP的最适温度为30—35℃或50—60℃，明显低于其他菌属的PNP（例如大肠杆菌PNP催化低浓度或高浓度的肌苷反应最适温度分别为50℃或60-70℃），这就使得在常规反应温度下（37℃），PiPNP使用较少的量就可获得较高的催化效率。但PiPNP相较于其他菌属的PNP也存在其缺陷——温度稳定性较低，将PiPNP保温30min，在37-42℃时酶活发生急剧变化，50℃完全失活，EcPNP在50-55℃发生急剧变化，65℃时完全丧失失活。

另外，据已报道的各方面研究，重组菌发酵生产的PNP产量仍较低，多为100～200U/ml，对于工业化生产而言，仍不能达到很好的效果，产量有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经过分子改造并具有较高热稳定性的嘌呤核苷磷酸化酶，以及高产量的制备该嘌呤核苷磷酸化酶的方法。

本发明第一方面提供了一种突变的假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶，与野生型的氨基酸序列相比，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突变为Tyr。

在另一优选例中，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一种或多种特性：

(a)比酶活≥30U/mg，较佳地为≥45U/mg；

(b)储存在碱性环境中；

(c)失活温度≥60℃；

(d)在0－55℃，保存时间≥3h。

在另一优选例中，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的最适PH值为7.0-9.0，较佳地为7.5-8.5，更佳地为8.0。

在另一优选例中，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶。

在另一优选例中，所述多核苷酸序列中编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leu134和Leu145的密码子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA中的一个或多个密码子被替换为大肠杆菌相对应的偏爱密码子。

在另一优选例中，所述多核苷酸序列中编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leu134和Leu145的密码子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA中的一个或多个密码子被替换为CGA、CTG、CTG、ATC、CTG和CTG。

在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体为表达载体，更佳地为适合在大肠杆菌中表达的表达载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含第三方面所述的载体或基因组中整合有第二方面所述的多核苷酸。